潘麗晶，張妙彬，梁擎中，范干群，程 萍

(珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣東 珠海 519070)

石斛屬是蘭科中最大的屬之一，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)至大洋洲。石斛蘭因其種類繁多、花姿優(yōu)美、花色艷麗、花期長(zhǎng)，其中許多種類還帶有芳香的氣味，既可盆栽觀賞，又可做成切花裝飾，深受人們喜愛(ài)，具有良好的市場(chǎng)前景。目前，國(guó)際上最具商業(yè)價(jià)值的幾個(gè)大屬的蘭花(包括石斛蘭)，普遍存在著病蟲(chóng)害嚴(yán)重、栽培和養(yǎng)護(hù)環(huán)境苛刻、成花周期長(zhǎng)、開(kāi)花控制難度大、花色花形不豐富等問(wèn)題[1]。其中，病害問(wèn)題乃是蘭花生產(chǎn)者最頭痛的問(wèn)題，因?yàn)槟壳暗奶m花主要是在溫室生產(chǎn)，溫室內(nèi)種植密集，且常年溫暖濕潤(rùn)，通風(fēng)不暢，極利于病蟲(chóng)繁殖和傳播，管理稍有不慎便會(huì)引發(fā)蘭花病害，而多數(shù)病害一旦發(fā)生即對(duì)蘭株造成永久的貶值，令生產(chǎn)者蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

在石斛蘭的各種病害中，軟腐病(soft rot)是主要的細(xì)菌性病害，該病菌在蘭科中可以危害蝴蝶蘭、文心蘭、石斛蘭、拖鞋蘭和狐貍尾蘭等，是目前臺(tái)灣蝴蝶蘭上最普遍最致命的病害之一。軟腐病的主要病原菌是歐氏桿菌Erwimiacarotovorasubsp.carotovora，歐氏桿菌的毒性基因表達(dá)受N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactone，AHL)信號(hào)分子的調(diào)控。因此，AHL信號(hào)分子為生物防治植物細(xì)菌病害提供了新靶點(diǎn)。Dong等[2]從芽孢桿菌一亞種Bacillussp.240B1中分離到一個(gè)編碼AHL水解酶類基因aiiA(autoinducer inactivation)。將aiiA基因?qū)霟煵莺婉R鈴薯，轉(zhuǎn)基因的煙草葉子和馬鈴薯塊莖對(duì)E.carotovora侵染的抗性明顯比非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組強(qiáng)，表現(xiàn)為侵染后不出現(xiàn)病斑或顯著推遲病斑的出現(xiàn)[3]。Lee等[4]發(fā)現(xiàn)aiiA基因廣泛存在于多個(gè)蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)亞種中，將這些aiiA基因與Dong等人[3]分離的aiiA基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列和編碼的蛋白序列的相似性分別高達(dá)89%～95%和90%～96%，并且證實(shí)，Bt的aiiA基因同樣可降解AHL致病信號(hào)因子以及降低E.carotovora致病的活性。2007年，柴鑫莉等將來(lái)自Bt經(jīng)密碼子優(yōu)化的人工合成aiiA基因?qū)肽в?，其AHL內(nèi)酯酶活性檢測(cè)表明轉(zhuǎn)基因植株魔芋葉片的蛋白可以降解AHL信號(hào)分子[5]。周燚[6]、張霞[7]也分別證實(shí)了Bt中aiiA基因的抗軟腐病活性。

近來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物新品種選育中日益發(fā)揮重要作用，也為石斛蘭的品種改良提供新途徑。至今，未見(jiàn)將aiiA轉(zhuǎn)入石斛蘭以及其它蘭花品種的相關(guān)報(bào)道。本研究從蘇云金芽孢桿菌(Bt)中克隆出aiiA，并將其裝載入植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中，利用根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)入石斛蘭，以期培育出具有軟腐病抗性的石斛蘭品種，進(jìn)而為其它蘭花品種的軟腐病防治提供新的參考和有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試驗(yàn)的石斛蘭品種為栽培于珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心蘭花資源圃的“大熊貓1號(hào)”(Dendrobiumekapol‘Panda no.1’)，取其自交種子經(jīng)無(wú)菌萌發(fā)的類原球莖(PLBs)為轉(zhuǎn)化受體。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 蘇云金芽胞桿菌Bt-10為中山大學(xué)龐義教授贈(zèng)送；質(zhì)粒載體pCAMBIA1301來(lái)自CAMBIA，Canberra, Australia；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、根癌農(nóng)桿菌(EHA105)(具有利福平抗性)為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 石斛蘭類原球莖(PLBs)的培養(yǎng) 取石斛蘭“大熊貓1號(hào)”的自交果實(shí)經(jīng)次氯酸鈉消毒，切開(kāi)果實(shí)將種子播種在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基+20 g·L-1蔗糖+1 g·L-1活性炭+8 g·L-1瓊脂粉，pH 5.8)上，25 ℃、每日光照16 h條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。一個(gè)月后取無(wú)菌萌發(fā)的類原球莖(PLBs)作為菌液侵染受體。

1.2.2 含aiiA基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)引物設(shè)計(jì)及PCR

根據(jù)pCAMBIA1301全序列和aiiA基因全序列特征，運(yùn)用DNASTAR軟件，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子、Nos polyA片段和aiiA基因全長(zhǎng)讀碼框的引物。

CaMV35S啟動(dòng)子：C1: 5′-GAATTCATGGTGGAGCACGACACT-3′(引入的位點(diǎn)：EcoRⅠ)

C2: 5′-GGTACCAGAGATAGATTTGTAGAG-3′(引入的位點(diǎn)：KpnⅠ)

Nos polyA：N1: 5′-CTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3′ (引入的位點(diǎn)：PstⅠ)

N2: 5′-AAGCTTCCCGATCTAGTAACATAG-3′ (引入的位點(diǎn)：HindⅢ)

aiiA基因：A1：5′-GGATCCATGACAGTAAA-GAAG-3′ (引入的位點(diǎn)：BamHⅠ)

A2：5′-CTGCAGCTATATATACTCAGG-3′ (引入的位點(diǎn)：PstⅠ)

(下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn))。引物由Invitrogen 公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50 ng，兩種引物各0.25 μmol·L-1，Taq酶0.5 U，dNTP 200 μmol·L-1。以pCAMBIA1301為模板擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子和Nos polyA片段，以Bt-10單菌落為模板擴(kuò)增aiiA基因，擴(kuò)增條件為：95 ℃變性5 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

(2)載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建策略如圖1所示。質(zhì)粒提取、酶切，DNA片段回收、連接、轉(zhuǎn)化等按文獻(xiàn)[8]的方法略加修改進(jìn)行。PCR產(chǎn)物連入pMD18-T克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)序列測(cè)定后，以相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，回收并純化，分別連入pCAMBIA1301，轉(zhuǎn)化DH5α，得到重組質(zhì)粒pSAN。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)一步經(jīng)ABI PRISM377(ersion3.3)自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)序鑒定。

圖1 植物表達(dá)質(zhì)粒pSAN的構(gòu)建

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的石斛蘭轉(zhuǎn)化 參照張秒彬等的方法[9]，取100 ～ 200 μL 保存于-70 ℃冰箱含表達(dá)載體pSAN的農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)接到40 mL附加利福平和卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至一定A600。取10 mL菌液，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，收集菌體，去上清，用20 mL稀釋培養(yǎng)基(1/2 MS基本培養(yǎng)基+20 g·L-1蔗糖，pH 5.5)重懸菌液。稍切去類原球莖的頂端，將其浸入農(nóng)桿菌侵染液中，28 ℃ 180 r/min侵染30 min。取出PLBs，用滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基(1/2 MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg·L-1BA+20 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉+100 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.5)，25 ℃暗培養(yǎng)5 d。將PLBs轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基(1/2 MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg·L-1BA+20 g·L-1蔗糖+1 g·L-1活性炭+8 g·L-1瓊脂粉+20 mg·L-1潮霉素+250 mg·L-1頭孢霉素，pH 5.8)，25 ℃培養(yǎng)，每日光照16 h。每隔20 d將存活PLBs進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶繼代培養(yǎng)，丟棄褐化死亡的PLBs。

1.2.4 抗性植株的檢測(cè) 當(dāng)抗性石斛蘭PLBs在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選5～6個(gè)月時(shí)已經(jīng)分化出葉片，這時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)。

(1)GUS染色檢測(cè):參照J(rèn)efferson等[10]的GUS組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。取抗性和對(duì)照植株的葉片浸于X-Gluc 染色液中，于37 ℃保溫3～12 h后，用乙醇脫色，觀察藍(lán)色斑點(diǎn)形成情況。

(2)PCR檢測(cè):采用張妙彬等的改良CTAB法(未發(fā)表)提取抗性石斛蘭小苗基因組DNA，分別擴(kuò)增T-DNA區(qū)域aiiA基因以及潮霉素抗性基因(hpt)片段片段。

hpt引物：HPT1: 5′-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCCG-3′;

HPT2: 5′-CGCATAACAGCGCTCATTGACTGGA-GC-3′。

引物A1與A2，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.2.2。反應(yīng)結(jié)束后，取樣5 μL在w=1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

以Bt-10單菌落為模板擴(kuò)增aiiA基因，取PCR產(chǎn)物4 μL電泳檢測(cè)，獲得約765 bp大小的條帶(圖2，泳道1)；以pCAMBIA1301為模板擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子和Nos polyA片段，分別得到520 bp和250 bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3，泳道1、2)。將3個(gè)片段分別克隆到pCAMBIA1301表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，得到重組質(zhì)粒pSAN，挑選陽(yáng)性克隆，純化質(zhì)粒，限制性酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期大小一致(見(jiàn)圖4泳道1，2)。

圖2 aiiA PCR產(chǎn)物

圖3 CaMV35S啟動(dòng)子和Nos polyA PCR產(chǎn)物

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化石斛蘭PLBs及潮霉素抗性苗的獲得

經(jīng)農(nóng)桿菌菌液侵染的PLBs放至共培養(yǎng)基上，黑暗下共培養(yǎng)5 d后，PLBs生長(zhǎng)狀態(tài)如圖5A所示。將轉(zhuǎn)化的PLBs及未轉(zhuǎn)化的PLBs(陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)至含潮霉素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔20 d記錄PLBs生長(zhǎng)情況，并將存活PLBs轉(zhuǎn)至新的選擇培養(yǎng)基上。PLBs經(jīng)過(guò)約2個(gè)月的選擇培養(yǎng)后，未轉(zhuǎn)化的PLBs (陰性對(duì)照) 在潮霉素篩選下已全部死亡(圖5:B), 而轉(zhuǎn)化的PLBs有部分表現(xiàn)出潮霉素抗性并長(zhǎng)出新的PLBs(圖5:C)。經(jīng)過(guò)了4個(gè)月的選擇培養(yǎng)，部分潮霉素抗性的PLBs再生成帶根的小植株(圖5:D)，可初步判斷其為轉(zhuǎn)基因植株。

圖4 重組質(zhì)粒pSAN酶切鑒定

圖5 石斛蘭PLBs共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和抗性苗再生情況

2.3 潮霉素抗性苗的GUS組織化學(xué)染色

挑取不同株系的潮霉素抗性類原球莖和抗性苗進(jìn)行GUS組織活性檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，抗性類原球莖出現(xiàn)藍(lán)色(圖6:B)，抗性苗的葉片和新長(zhǎng)出的根也出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)(圖6:C)，而對(duì)照未出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)(圖6:A)。

圖6 轉(zhuǎn)基因石斛蘭的GUS染色

2.4 抗性苗的PCR檢測(cè)

提取GUS染色陽(yáng)性的3株抗性苗的葉片基因組DNA，利用特異引物對(duì)(A1和A2)和(HPT1和HPT2)進(jìn)行aiiA基因和hpt基因的PCR 擴(kuò)增。

圖7 潮霉素抗性苗PCR檢測(cè)

圖7A可以看到3株抗性苗均擴(kuò)增出765 bp大小的片段，B可以看到3株抗性苗擴(kuò)增出375 bp大小的片段，與預(yù)期aiiA和hpt的擴(kuò)增片段大小一致，而未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

從抗性苗的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果以及外源基因hpt和aiiA的PCR結(jié)果可證實(shí)這些抗性苗為轉(zhuǎn)基因苗。

3 討 論

植物軟腐病是一種嚴(yán)重的世界性流行病害，在全球范圍內(nèi)廣泛分布。軟腐病由歐文氏菌屬的細(xì)菌引起， 蘭花各種屬易受細(xì)菌性軟腐病侵害，植株和切花品質(zhì)因此大為下降。在一些植物的轉(zhuǎn)基因研究中已證實(shí)蘇云金芽孢桿菌中含有的aiiA基因具有抵抗細(xì)菌性軟腐病的作用，在蘭花的病蟲(chóng)害防治和育種研究中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文從蘇云金芽孢桿菌(Bt)中克隆出aiiA基因，并將其裝載入植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌EHA105將該基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)入石斛蘭。目前，已經(jīng)獲得了含aiiA的轉(zhuǎn)基因苗，這將進(jìn)一步為利用轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)造抗病力強(qiáng)的石斛蘭品種以及蘭花的病蟲(chóng)害防治打下基礎(chǔ)。由于石斛蘭轉(zhuǎn)基因苗生長(zhǎng)緩慢，至今還不足以進(jìn)行下一步的功能驗(yàn)證。待轉(zhuǎn)基因植株可移栽至溫室并生長(zhǎng)穩(wěn)定以后，將對(duì)其進(jìn)行軟腐病病原菌的接種，以驗(yàn)證該aiiA對(duì)轉(zhuǎn)基因石斛蘭植株表現(xiàn)出軟腐病抗性。

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