許子志　王　川

【摘要】 目的 構(gòu)建正義、反義Id1真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞系，篩選穩(wěn)定表達細胞株。方法 設(shè)計針對Id1基因的mRNA效的干擾序列。將干擾序列插入pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR 表達載體，構(gòu)建Id1 miRNA真核表達載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞系，殺稻瘟霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞株。結(jié)果 Id1 miRNA真核表達載體的構(gòu)建后，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后。轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB231細胞系。經(jīng)過2周殺稻瘟霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達的細胞系。經(jīng)RT-PCR鑒定，轉(zhuǎn)染Id1 miRNA真核表達載體的細胞系Id1表達水平低于對照組。未轉(zhuǎn)染組與陰性對照轉(zhuǎn)染組無明顯差異。

【關(guān)鍵詞】Id1； 真核表達載體； 乳腺癌

Construct the eukaryotic expression vector of Id1 miRNA and transfect into breast caner cell line

XU Zi-zhi,WANG Chuan.Institute of Tumor Disease, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001,China

【Abstract】 Objective To construct the miRNA eukaryotic expression vector of Id1 and successfully transfect the MDA-MB-231 cell lines of breast cancer and finally select the stabilized expressed cells lines. Methods To design miRNA array of Id1 gene. to insert the target gene into pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR to construct the Id1 miRNA eukaryotic expression vector. The liposome infection protocol transfect the MDA-Mb231 cell lines of breast cancer. Use Blasticidin to select stabilized expressed cell lines. Results The method of RT-PCR helps to acquire the whole Id1 array for about 212bp long. After identifying by enzyme and measuring array, it transfect the MDA-MB231 cell lines of breast cancer. We acquire the stabilized expressed cell lines through 2W Blasticidin selection. As a result of RT-PCR identification, the level of Id1 of Id1 miRNA transfection cell lines is lowerer than that of the other two groups. While the level of Id1 is no difference between the negative control transfection cell lines and negative control cell lines group.

【Key words】 Id1；Eukaryotic expression vector；Breast cancer

Id1(Inhibition of DNA binding/differentiation)蛋白是一類具有螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)的分子，是一組缺乏堿性DNA連接結(jié)構(gòu)域的HLH因子。Id1可與一類具有bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成無功能的異源二聚體，從而抑制下游一些包含有E-box(CANNTG)或E樣序列的靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其顯性負性調(diào)節(jié)功能。干擾了DNA與bHLH的結(jié)合，抑制細胞分化，促進細胞增殖, 因此Id蛋白被認為是分化和DNA結(jié)合的抑制劑。在組織細胞的發(fā)育分化及增殖中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)Id家族的蛋白在許多腫瘤中的表達是上調(diào)的^［1-4］，研究證實其參與腫瘤的發(fā)生，與腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)^［4］。在某些惡性腫瘤中，有Id1蛋白的高表達，這種高表達與腫瘤的惡性度、侵襲性及新生血管的形成等成正比。該分子在基因表達調(diào)控、細胞增殖、腫瘤發(fā)生和血管生成方面可能具有中心性的作用。

1 資料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞MDA-MB-232細胞株購自上海雅培公司。pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR表達載體，載體試劑盒，BLOCK-iT miR RNAi select引物，DH5α感受態(tài)菌，陰性對照克隆甘油菌（Negative control），均購自invitrogen公司。大觀霉素購自魯抗制藥公司。干擾序列及引物序列由invitrogen公司公司合成。質(zhì)粒提取試劑盒購自 TAKALA公司。高純度質(zhì)粒提取純化試劑盒（MIDI）購自Qiagen公司。Sc734-Id1單抗（兔源）和sc2007羊抗兔多克隆抗體購自Santa-Cruz公司。lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。殺稻瘟霉素購自Invitrogen公司。RT試劑盒A3500購自PROMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計與合成 利用Invitrogen公司網(wǎng)上BLOCK-iT miR RNAi設(shè)計工具。對基因(ID：3397)的兩個轉(zhuǎn)錄版本mRNA（NM-002165.2和NM-181353.1）都有效的干擾序列。經(jīng)BLAST篩選得到4對micmRNA正反鏈核苷酸。由invitrogen公司公司合成。其中No.2，No.3對信息如下：No.2F TGCTGTTGAGGCGTGAGTAACAGCCGGTTTTGGCCA CTGACTGACCGGCTGTTTCACGCCTCAA；No.2R CCTGTTGAGGCGTGAAACAGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCTGTTACTCACGC CTCAAC；No.3FTGCTG AACTGAAGGTCCCTGATGTAGGTTTTGGCCAC TGACTGACCTACATCAGACCTTCAGTT；No.3R CCTGAACTGAAGGTCTGATGTAGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCTA CATCAGGGACCTTCAGTTC。

1.2.2 克隆步驟 oligo退火,連接,再轉(zhuǎn)化:取5 μl連接液加入100 μl的DH5α感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，最后將細胞涂布于含50 μg/ml壯觀霉素的LB平板，平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。陽性克隆PCR鑒定:從轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒感受態(tài)細菌的兩組壯觀霉素（50 μg/ml） LB瓊脂平板挑取轉(zhuǎn)化新鮮菌落，用質(zhì)?；厥赵噭┖谐樘醿山M質(zhì)粒行PCR鑒定，使用載體通用測序引物進行PCR，引物序列分別為：5′-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3′，5′-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3′。陽性克隆PCR產(chǎn)物約為250 bp，產(chǎn)物經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳后，在約250 bp處有一條相應(yīng)的電泳條帶，說明目的片段與載體正確連接。質(zhì)粒抽提:取2 ml保留的陽性克隆菌液，用質(zhì)粒抽提試劑盒進行抽提。對抽提的質(zhì)粒進行測序驗證。

1.2.3 分組轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA-MB231細胞株及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

用Qiagen Tip100 Plasmid Midi 純化試劑盒大量抽提高純度質(zhì)粒Id1-pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR、及陰性對照質(zhì)粒（Negative control）。取所獲DNA 5μl，60倍稀釋，以紫外分光光度計測定OD260、OD280及比值，確定濃度及純度。MDA-MB231乳腺癌細胞以含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于75 ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃；5%CO2；100%濕度，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3~4 d，傳代一次。同時用不同濃度殺稻瘟霉素殺傷細胞以確定合適的藥物篩選濃度（6 ng/L）。轉(zhuǎn)染前1 d，選取處于對數(shù)生長期的細胞，用臺盼藍染色計算MDA-MB231細胞存活率，選用存活率大于或等于97%細胞,隨機分組，使用Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將三組質(zhì)粒（No.2 ,No.3及negative control）分別轉(zhuǎn)染三組乳腺癌MDA-MB231細胞中。無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h。吸棄轉(zhuǎn)染混合液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液。37℃ 5%CO2 100%濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。棄上清，加入含6 μg/ml殺稻瘟霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液。每3 d換液一次，直到多克隆細胞株出現(xiàn)。4周后，具有抗性的多克隆細胞株形成細胞團后，挑取陽性克隆至12孔板培養(yǎng)繼續(xù)擴增，然后轉(zhuǎn)種至75 ml細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 重組質(zhì)粒所編碼的Id1RNA在乳腺癌細胞MDA-MB231細胞株中的表達與分析 實驗分為四組；第一組為未轉(zhuǎn)染組。第二三組為分別轉(zhuǎn)染No.2,No.3組，第四組為轉(zhuǎn)染negative control陰性對照載體的細胞克隆組，取出兩組分別轉(zhuǎn)染pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR； 空白Negative control質(zhì)粒的細胞各一瓶，及未轉(zhuǎn)染細胞一瓶，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS洗三次。每個細胞培養(yǎng)瓶中加入Trizol裂解液 1 ml，細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫下放置5 min； 在EP管中，加0.2 ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15 s，在室溫下放置2~3 min后，12 000 g（4℃）離心15 min； 取上層水相置于新EP管中,加0.5 ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下放置10 min,12 000 g（4℃）離心10 min；棄上清， 1 ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7 500 g（4℃）離心5 min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。以紫外分光光度計測定OD 260、OD 280及比值，確定濃度及純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，A3500）合成cDNA，配制20 μl反應(yīng)體系：RNAsin 20 U，Oligo (dT) 150.5 μg，RNA模板1.5 μg，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1 mmol/L，AMV反轉(zhuǎn)錄酶15 U，dNTPs 1 mmol/L，MgCl2 25 mmol/L，混勻后42℃反應(yīng)1 h，95℃ 5 min，4℃放置10 min。PCR反應(yīng)體系50 μL：模板cDNA（約50 ng），上、下游引物（各50 pmol/L）引物序列分別為：5′-GCAAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC-3′，5′-GCTTCAGCGACACAAGATGCGATC-3′ 212 bp。，94℃ 4~5 min，立即冰浴，瞬時離心，加入PCR緩沖液（4.8 μl），MgCl2（3.8 μl），dNTPs（0.9 μL），Taq酶（Promega公司，M1661） 2.5 U，最后加無核酸酶的水定容為50 μl。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5 min，94℃ 60 s, 56℃ 60 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)。 PCR產(chǎn)物5 μl經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆PCR鑒定PCR產(chǎn)物電泳圖譜：

M：marker 1~4: No.15~8: No.29~12: No. 313~16: No.4

陽性克隆PCR產(chǎn)物約為250 bp，產(chǎn)物經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳后，在約250 bp處有一條相應(yīng)的電泳條帶，說明目的片段與載體正確連接。

2.2 重組質(zhì)粒的序列測定 經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)公司測序，送檢序列與同合成序列相符，載體構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)染后綠熒光蛋白表達

2.4 在重組質(zhì)粒Id1-pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體的細胞克隆中，重組的目的基因包含ID1 miRNA序列，可表達Id1 miRNA，抑制細胞克隆中的Id1 RNA表達水平。

A．無轉(zhuǎn)染組B.轉(zhuǎn)染No.2組C.轉(zhuǎn)染No.組D. negative control陰性對照轉(zhuǎn)染組 M:Marcker

結(jié)果證實兩組轉(zhuǎn)染載體的細胞克隆中Id1表達與其他組不相同。穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒Id1-pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體No.2，No.3的兩組細胞克隆中Id1RNA的表達水平降低；整合negative control陰性對照載體的細胞克隆中Id1RNA的表達水平與無轉(zhuǎn)染組相似。

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。且近年來發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。乳腺癌的浸潤，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致許多女性死亡的重要原因?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)Id1過度表達與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

HLH轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)細胞生長和分化的重要因子，大多數(shù)HLH蛋白屬于堿性HLH(bHLH)家族成員，包括高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域和堿性DNA結(jié)合區(qū)。HLH結(jié)構(gòu)域使這些蛋白形成特定的同源或異源二聚體，從而獲得轉(zhuǎn)錄活性。DNA結(jié)合區(qū)通過與E盒序列結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用。Id分子通過競爭性的抑制其他bHLH家族成員轉(zhuǎn)錄激活的功能。從而負向調(diào)控基因表達與細胞分化，促進腫瘤的發(fā)生，增殖、去分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。ID1的異常表達可誘導(dǎo)乳腺癌細胞持續(xù)增殖，當(dāng)下調(diào)Id1表達時可導(dǎo)致細胞周期素cyclin D1和cyclin E的表達下降，和cyclin E-cdk2活性降低，以及PRB的ser780位點的磷酸化程度降低，從而促進細胞周期進程，誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖^［5］。Id1過表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，在早期乳腺癌中Id1通過cyclin D1來促進癌細胞增殖^［6］，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程Id1能通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。Id類蛋白還可能通過誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成而參與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。在ER陰性或弱陽性的乳腺癌中腫瘤中微血管密度與Id1過表達相關(guān)^［7］。Id1可與Ras通過抑制細胞衰老來誘導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移^［8］，Gupta GP, Perk J等研究表明Id1與ID3在三陰性乳腺癌來群的惡性行為中起重要作用^［9］，Id家族成員具有一些癌蛋白的屬性^［10］。研究表明Id蛋白特別是Id1，可通過滅活腫瘤抑制因子和激活生長促進通路而促進哺乳動物細胞的增殖和細胞周期的進行，其可能是腫瘤增殖所必需的關(guān)鍵因子^［11］。

Id1分子與乳腺癌的密切關(guān)系，可能對乳腺癌的早期診斷和治療提供新的靶點。本實驗成功構(gòu)建Id1 miRNA真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB231細胞株，篩選出穩(wěn)定表達Id1蛋白的乳腺癌細胞株，為將來進一步研究他們之間的生物學(xué)行為差異，或詳細了解其分子作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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