時晶晶　李　青

摘要：本文對春石斛叢生芽繁殖途徑的啟動培養(yǎng)進行了研究。結(jié)果表明：假鱗莖作為外植體，最佳滅菌方法是：75%酒精進行表面滅菌30s，無菌水沖洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡6min，最后用無菌水沖洗5～6次；理想的啟動培養(yǎng)基是：MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L，啟動培養(yǎng)效果最好；外植體的取材時間應(yīng)選在11月，側(cè)芽萌發(fā)所用時間較短，在8～10天之間；褐化現(xiàn)象不嚴(yán)重，可通過連續(xù)轉(zhuǎn)接得以緩解。

關(guān)鍵詞：春石斛；叢生芽；組織培養(yǎng)

春石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛屬的一類氣生蘭。其花姿優(yōu)雅、花色鮮艷、花期較長，被譽為“四大洋蘭之一”，被許多花卉生產(chǎn)企業(yè)看作是未來的“洋蘭之星”，發(fā)展前景非常好。目前生產(chǎn)上多采用莖段或高芽扦插的方法進行繁殖，增殖率低，苗不一致，很難達到商品化要求[1]。故春石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的研究非常必要。

目前，春石斛無菌體系的建立主要是無菌播種[2]、誘導(dǎo)原球莖[3，4]和誘導(dǎo)叢生芽[5-7]3個途徑。春石斛是復(fù)莖性蘭花，腋芽來源廣泛，再生能力強，可利用帶側(cè)芽莖段為外植體建立再生體系。本文就叢生芽繁殖途徑的啟動培養(yǎng)進行初步研究，為春石斛的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

以春石斛品種‘桃太郎（Den.Yohkou ‘Peach boy）作為實驗材料，本品種屬于大花品種，株形高大，約60cm，節(jié)長3~4cm?；ㄉ珵樽霞t色，唇瓣帶白色環(huán)，邊緣為紫紅色，唇盤深紫色，盛開時非常美麗。

1.2方法

1.2.1實驗材料預(yù)處理。選擇生長充實、飽滿、黃色的假鱗莖，將葉片去掉，切成3cm左右的小段。先用洗潔精浸泡15min,沖洗泡沫后，流水沖洗1h。

1.2.2外植體的滅菌和接種。在超凈工作臺里，將莖段先用75%酒精進行表面滅菌30s，無菌水沖洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡（過程中不斷震蕩），最后用無菌水沖洗5~6次（每次2min），種時將莖段兩端直接接觸升汞的部位切掉，按生長方向插入培養(yǎng)基。

1.2.3培養(yǎng)條件。溫度：25±2℃；光照強度：2000~3000Lx；光照時間：12h/d。

1.2.4培養(yǎng)基。以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的外源激素，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH值為5.8。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計。污染率（%）=（污染的外植體個數(shù)/接種的總數(shù)）×100；誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出芽的個數(shù)/未污染外植體的個數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1滅菌時間的選擇

外植體的滅菌是無菌體系建立的關(guān)鍵，為了能充分滅菌，又不會將植物體殺死，需要選擇合適的滅菌時間。本試驗設(shè)置4min、6min、8min、10min4個滅菌時間，統(tǒng)計污染率和死亡率（見表1）。

由表1可以看出，隨著滅菌時間的增加，外植體的污染率下降，滅菌時間為10min的時候，污染率為0。從試驗結(jié)果看出，該品種帶菌情況并不嚴(yán)重，因為材料一直在溫室栽培，環(huán)境相對潔凈。滅菌4min污染率較高。滅菌時間6min和8min比較，未污染且存活的外植體分別為80%和76.7%，雖然6min的污染率較8min高，但死亡率為0，說明升汞對外植體的傷害小，浸泡8min對外植體的傷害較大，可能會影響側(cè)芽的萌發(fā)。綜合比較，6min滅菌時間最理想。

2.2培養(yǎng)基的選擇

本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素和生長素，設(shè)置了8種配方，每配方接種30瓶，重復(fù)5次。統(tǒng)計側(cè)芽萌發(fā)時間和50天的苗高（見表2）。

①:1/2MS+BA 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;

②:MS+BA 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;

③:MS+BA 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L;

④:MS+BA 2.0ml/L+NAA 0.1ml/L;

⑤:MS+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;

⑥:MS+KT 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L;

⑦:MS+KT 2.0ml/L+NAA 0.1ml/L;

⑧:MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L。

盡管⑥和⑦號培養(yǎng)基的平均苗高遠大于其他配方，增殖系數(shù)也較為理想，但是苗的生長狀況不好，葉片過長，且有些苗生長畸形，并不能被繼代培養(yǎng)所用；綜合各個指標(biāo)，⑧號培養(yǎng)基的苗生長狀況最好，增殖系數(shù)也理想，故被選作啟動培養(yǎng)基。

2.3外植體取材時間的比較

分別在6月和11月取材，0.1%升汞滅菌6min，接種于⑧號培養(yǎng)基。6月外植體側(cè)芽萌發(fā)時間在11~13天間，而11份外植體側(cè)芽萌發(fā)時間在8~10天間，且苗的長勢較6月接種的好（見表3）。故11月取外植體明顯好于6月。這可能是與春石斛生態(tài)習(xí)性有關(guān)。春石斛從春季生長開始，到夏季末終止葉形成前，假鱗莖一直在增高。終止葉形成后，假鱗莖開始增粗，直到開花前，假鱗莖內(nèi)的營養(yǎng)成分大量積累，故在這期間取材作為外植體比較理想。

2.4不同外植體材料啟動培養(yǎng)的結(jié)果比較

本試驗分別用假鱗莖的帶芽莖段、葉片和根段作外植體，比較不同材料對叢生芽的誘導(dǎo)結(jié)果。將3種外植體分別接種在MS+BA 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L上，50天時統(tǒng)計誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)狀況（見表4）。

由表4可知，誘導(dǎo)叢生芽的最佳外植體是莖段側(cè)芽，誘導(dǎo)率可以達到91.7%，但培養(yǎng)初期，叢生芽增殖并不顯著；葉片和根段作為外植體無法誘導(dǎo)出叢生芽，且在培養(yǎng)過程中，逐漸褪綠死亡。

3 小結(jié)與討論

叢生芽繁殖是春石斛離體繁殖的主要途徑。春石斛品種‘桃太郎帶側(cè)芽的假鱗莖段作為外植體，最佳滅菌方法是：75%酒精進行表面滅菌30s，無菌水沖洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡6min，最后用無菌水沖洗5~6次；理想的啟動培養(yǎng)基是：MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L；外植體的取材時間選在11月，側(cè)芽萌發(fā)所用時間較短，在8～10天之間。

蘭花類組織培養(yǎng)普遍存在褐化的問題，本試驗中并不明顯。側(cè)芽萌發(fā)后將其切下，接入新的培養(yǎng)基，有幾瓶存在培養(yǎng)基顏色發(fā)紅的現(xiàn)象，但并不嚴(yán)重，可以通過及時更換培養(yǎng)基緩解，也可加入少量活性炭。但是繼代過程中是否會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，有待進一步觀察研究。本試驗發(fā)現(xiàn)春石斛的增殖系數(shù)并不大（最大才2.40），繼代過程中如何提高增殖系數(shù)有待進一步研究。

（收稿:2008-12-20）

參考文獻：

1.中國林業(yè)科學(xué)研究院花卉研究與開發(fā)中心. 石斛蘭—資源的生產(chǎn)與應(yīng)用[M] 北京：中國林業(yè)出版社，2007

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6.胡如善，孫廷，楊玉珍.霍山石斛的離體培養(yǎng)研究.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，（4）：72～76

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