孫燕 姚瑋艷 張永平 喬敏敏 袁耀宗

·論著·

間隙連接蛋白43對胰腺癌細(xì)胞株BxPC3凋亡的作用及其機制研究

孫燕 姚瑋艷 張永平 喬敏敏 袁耀宗

目的研究間隙連接蛋白43(Cx43)在胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用，并探討其機制。方法采用脂質(zhì)體2000法將pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、空質(zhì)粒pcDNA3.0、siRNA-Cx43和對照siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞。Western blotting檢測細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)、細(xì)胞色素C(Cyt C)含量；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位；熒光分光光度計檢測細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3活性；染料傳遞法測定細(xì)胞間間隙連接(GJ)。結(jié)果Cx43轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞后， Cx43蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡從空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的(6.35±0.43)%增加到(14.29±1.24)%，經(jīng)H2O2處理后，從(20.34±2.47)%增加到(31.27±2.56)%(Plt;0.05)，同時線粒體膜電位下降，Cyt C從線粒體釋放增多，Caspase蛋白酶活性增加；而siRNA43干擾細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡從(7.42±0.47)%減少到(5.19±1.37)%，經(jīng)H2O2處理后，從(19.43±1.71)%減少到(11.67±1.97)%(Plt;0.05)，線粒體膜電位去極化，Cyt C從線粒體釋放減少，Caspase酶活性下調(diào)。細(xì)胞間間隙連接指數(shù)在無GJ抑制劑β-GA情況下從對照組的14.52±0.57增加到pcDNA-Cx 43轉(zhuǎn)染組的23.05±3.84，在存在β-GA情況下從1.70±0.24增加到3.84±0.45(Plt;0.05)，但細(xì)胞凋亡率改變無顯著差異。結(jié)論Cx43可通過線粒體凋亡途徑促進BxPC3細(xì)胞凋亡，Cx43調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡存在間隙連接以外的機制。

胰腺腫瘤； 連接蛋白43； 間隙連接； 細(xì)胞凋亡

間隙連接(gap junction，GJ)由間隙連接蛋白(connexins，Cx)構(gòu)成，相鄰細(xì)胞通過間隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞間間隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)進行信息、能量和物質(zhì)的交換[1],在維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用[2]。目前已確定人類有21種連接蛋白[3]。研究發(fā)現(xiàn)，許多促癌物通過抑制Cx的途徑阻斷GJIC，使細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控信號傳遞失控，而凋亡誘導(dǎo)劑可以增強Cx表達(dá)和GJIC功能，從而抑制腫瘤的生長和惡性轉(zhuǎn)化[4]。Cx43 作為最常見的一種連接蛋白，主要在心肌、平滑肌、胰腺等多種組織細(xì)胞表達(dá)。本實驗將插入Cx43的載體和針對Cx43的siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株BxPC3，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡的變化，探討Cx43在細(xì)胞凋亡中的作用機制。

材料與方法

一、siRNA-Cx43、siRNA-NC和pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N載體的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

針對Cx43的siRNA(siRNA-Cx43)和陰性對照siRNA(siRNA-NC)合成及轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞由我們前期工作完成[5]。

按Homo sapiens Cx43基因序列使用primer5軟件設(shè)計Cx43引物。上游序列為5′-CCCAAGCTTGGGATGGGTGACTGGAGCGCC-3′，下游序列為5′-CGCGGATCCGCGCTAGATCTCCAGGTCATC-3′，上游序列引入HindⅢ酶切位點，下游序列引入BamHⅠ酶切位點，引物由上海生工公司合成。目的產(chǎn)物1173 bp。將PCR擴增的產(chǎn)物通過酶切，再連接至質(zhì)粒pcDNA3.0。重組質(zhì)粒pcDNA-Cx43常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5a，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，挑取單克隆搖菌，菌液經(jīng)測序鑒定正確后大量制備。同時，根據(jù)Cx43第130～136位氨基酸殘基缺失突變可抑制GJ生成[6]的原理，設(shè)計Cx43突變體(Cx43N)的引物。上游為5′-GACATGCACTTGAAGCAGTACGGTATTGAAGAGCAT-3′，下游為5′-CTGTACGTGAACTTCGTCATGCCATAACTTCTCGTA-3′。以pcDNA-Cx43載體DNA為模板，根據(jù)基因定點突變試劑盒(碧云天公司)操作手冊進行PCR擴增。突變產(chǎn)物同樣插入pcDNA3.0，重組質(zhì)粒pcDNA-Cx43N轉(zhuǎn)化大腸桿菌、測序鑒定和質(zhì)粒大量制備。

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3購自美國ATCC，以3×105/孔接種于6孔板中，置無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至90%～95%融合時，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)說明書，將pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N和空載體pcDNA3.0分別轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞。同樣，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)30%～50%時，將siRNA-Cx43和siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞。

二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的檢測

抽提各轉(zhuǎn)染組BxPC3細(xì)胞蛋白，常規(guī)Western blotting檢測Cx43蛋白表達(dá)。

三、細(xì)胞凋亡檢測

采用AnnexinⅤ/PI雙染法。將5個轉(zhuǎn)染組BxPC3細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板培養(yǎng)，每組設(shè)6個復(fù)孔。24 h后其中3個孔加凋亡誘導(dǎo)劑H2O2400 μmol/L，3個孔不加，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC(20 mg/L)和5μl PI(50 mg/L)，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀分析。以親本BxPC3細(xì)胞作為對照。

將pcDNA-Cx43 、pcDNA3.0轉(zhuǎn)染的BxPC3細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入H2O2400 μmol/L。24 h后其中3個孔加50 μmol/L GJ抑制劑β-GA，3孔不加，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同法測細(xì)胞凋亡率。

四、線粒體膜電位檢測

按照線粒體膜電位檢測試劑盒Invitrogen公司說明書操作。設(shè)6個復(fù)孔的pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43和siRNA-NC轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，其中3個孔加400 μmol/L H2O2，另3個孔不加，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml，加入10 μl 200 μmol/L的JC-1，繼續(xù)培養(yǎng)15～30 min。以親本細(xì)胞為陽性對照，加入1 μl CCCP (線粒體電子傳遞鏈抑制劑)，37℃孵育5 min。各組細(xì)胞洗滌、重懸后用流式細(xì)胞儀分析。線粒體膜電位較高時，JC-1產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時，JC-1產(chǎn)生綠色熒光，以綠光/紅光表示，比值高，膜電位低。

五、細(xì)胞色素C(Cyt C)釋放水平檢測

收集5個轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液， 750 g離心10 min，取上清，再10 000 g離心15 min，取上清。Western blotting法檢測Cyt C的水平。

六、Caspase-9和Caspase-3酶活性檢測

按Caspase-9和Caspase-3酶活性檢測試劑盒(Biovision公司)說明書操作。收集培養(yǎng)48 h的5個轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，PBS洗滌后加熒光底物37℃反應(yīng)1 h，應(yīng)用熒光分光光度計分析。以親本BxPC3測定值作為基數(shù)1，其他各組細(xì)胞以其的倍數(shù)表示。

七、細(xì)胞間間隙連接檢測

采用Kapoor等[7]提出的染料傳遞實驗方法進行。5個轉(zhuǎn)染細(xì)胞組設(shè)6個復(fù)孔培養(yǎng)24 h，其中3孔加50 μmol/L GJ抑制劑β-GA(Sigma公司)，3孔不加，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用可穿過間隙連接的發(fā)綠色熒光染色的探針Calcein-AM(Invitrogen公司)標(biāo)記作為供體細(xì)胞。用發(fā)紅色熒光的細(xì)胞膜標(biāo)記探針DiIC18處理的親本BxPC3細(xì)胞作為受體細(xì)胞。以供體∶受體1∶5的比例共孵育2 h，用流式細(xì)胞儀分析。如果供體和受體細(xì)胞間存在間隙連接，綠色的calcein-AM將從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至紅色的受體細(xì)胞使受體細(xì)胞變成橙色。細(xì)胞間間隙連接指數(shù)=發(fā)生細(xì)胞間間隙連接細(xì)胞數(shù)/總的受體細(xì)胞數(shù)/供體細(xì)胞數(shù)。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的變化

pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細(xì)胞Cx43表達(dá)增加，而siRNA-Cx43組細(xì)胞的Cx43表達(dá)較siRNA-NC組顯著減少(圖1)。

二、細(xì)胞凋亡率的變化

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組及親本BxPC3細(xì)胞未經(jīng)H2O2處理的細(xì)胞凋亡率分別為(14.29±1.24)%、(12.53±2.32)%、(6.35±0.43)%、(5.19±1.37)%、(7.42±0.47)%和(4.57±0.51)%；經(jīng)H2O2處理的細(xì)胞凋亡率分別為(31.27±2.56)%、(29.41±2.86)%、(20.34±2.47)%、(11.67±1.97)%、(19.43±1.17)%和(18.63±1.29)%。pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N組細(xì)胞凋亡率較pcDNA3.0組和親本組顯著增加(Plt;0.05)；siRNA-Cx43與siRNA-NC組及親本組的凋亡率在無H2O2處理時無顯著差異，而在H2O2處理后，表達(dá)顯著下調(diào)(Plt;0.05)。

圖1 Cx43蛋白表達(dá)

三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞線粒體膜電位、Caspase-9，-3活性、Cyt C釋放的變化

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組未經(jīng)H2O2處理時細(xì)胞線粒體的比值分別為0.27±0.04、0.22±0.05、0.12±0.02、0.15±0.01、0.19±0.04；H2O2處理后分別為0.58±0.05、0.53±0.02、0.35±0.07、0.21±0.07、0.40±0.05。pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細(xì)胞的線粒體膜電位較pcDNA3.0組顯著降低(Plt;0.05)，而siRNA-Cx43組細(xì)胞的膜電位較siRNA-NC組顯著增加(Plt;0.05)。

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組未經(jīng)H2O2處理時細(xì)胞的Caspase-9及Caspase-3活性分別為2.43±0.58、2.07±0.47、1.19±0.17、1.32±0.19、1.72±0.27以及1.35±0.32、1.17±0.21、0.84±0.24、1.12±0.27、1.47±0.11；經(jīng)H2O2處理后分別為6.85±0.67、6.34±0.57、3.82±0.54、2.43±0.28、4.52±0.74以及5.41±0.67、4.93±0.17、2.44±0.47、1.52±0.09、2.54±0.17。pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細(xì)胞的Caspase-9、-3活性明顯高于pcDNA3.0組(Plt;0.05)，而siRNA-Cx43組細(xì)胞的Caspase-9、-3活性較siRNA-NC組顯著降低(Plt;0.05)。

pcDNA-Cx 43組細(xì)胞胞質(zhì)CytC含量較其他幾組顯著增加；經(jīng)H2O2處理后，pcDNA-Cx 43組胞質(zhì)Cyt C含量依然明顯升高，而低表達(dá)Cx43細(xì)胞胞質(zhì)CytC含量明顯減少(圖2)。

四、BxPC3細(xì)胞凋亡與GJIC的關(guān)系

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組細(xì)胞間間隙連接指數(shù)在無β-GA情況下分別為23.05±3.84、13.11±0.68、14.52±0.57、5.45±0.24、13.20±2.31；存在β-GA情況下分別為3.84±0.45、1.24±0.22、1.70±0.24、0.45±0.17、2.31±0.27。pcDNA-Cx 43組的細(xì)胞間間隙連接指數(shù)明顯高于其他各組，而siRNA-Cx43組明顯下降(Plt;0.05)。但pcDNA-Cx43組在存在或不存在β-GA情況下的細(xì)胞凋亡率分別為(25.82±1.47)%和(31.12±1.38)%，pcDNA3.0組分別為(17.12±0.98)%和(20.04±1.25)%，無顯著差異。提示GJIC與細(xì)胞凋亡無關(guān)聯(lián)。

圖2 各組細(xì)胞胞質(zhì)中Cyt C蛋白含量

討 論

多種惡性腫瘤細(xì)胞普遍存在著Cx基因表達(dá)的嚴(yán)重受抑、缺失和間隙連接通訊功能的缺陷，而且腫瘤的惡性程度與Cx43基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這一功能的恢復(fù)又表現(xiàn)出腫瘤生長控制和轉(zhuǎn)化表型抑制[8]。如用RNA干擾下調(diào)Cx43的表達(dá)可促進乳腺癌細(xì)胞的惡性表型[9];將Cx43 基因轉(zhuǎn)染至Cx43基因缺陷的HeLa細(xì)胞，Cx43表達(dá)上調(diào)，癌細(xì)胞的生長明顯緩慢、惡性表型受抑制[10]。本實驗也顯示了Cx43轉(zhuǎn)染的BxPC3細(xì)胞凋亡增加，而下調(diào)Cx43的表達(dá)，能減少細(xì)胞凋亡，表明Cx43對BxPC3的凋亡具有保護作用。

Cx43及其組成的GJ與細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡、生長的調(diào)控有著密切的關(guān)系。這一調(diào)控作用可以通過GJ也可以不通過GJ 起作用[11]。本文應(yīng)用GJ抑制劑β-GA抑制細(xì)胞間間隙連接通訊。結(jié)果轉(zhuǎn)染Cx43的BxPC3細(xì)胞的GJIC明顯減少，但是由H2O2引起的凋亡卻未明顯受到抑制，表明可能有細(xì)胞間間隙連接以外的機制參與Cx43調(diào)節(jié)凋亡的過程。

線粒體凋亡是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的主要原因，線粒體膜電位下降通常是線粒體凋亡過程中最早發(fā)生的事件。Cyt C從線粒體內(nèi)釋放至胞質(zhì)是線粒體步入凋亡途徑的一個標(biāo)志，線粒體釋放的CytC可以激活Caspase蛋白酶家族，從而引起細(xì)胞凋亡。Boengler等[12]報道，Cx43除可定位于細(xì)胞膜上，還可定位于線粒體膜上。本研究顯示，Cx43轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞后，細(xì)胞的線粒體膜電位下降，CytC從線粒體釋放增加，Caspase酶活性上調(diào)；而用siRNA下調(diào)BxPC3的Cx43表達(dá)，如果相反，提示Cx43對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用依賴線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但Cx43是通過何種信號分子作用從而激活線粒體凋亡途徑的的機制目前尚未清楚，有待進一步研究。

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2008-09-10)

(本文編輯：屠振興)

Roleofconnexin43inapoptosisofpancreaticcancercelllineBxPC3

SUNYan,YAOWei-yan,ZHANGYong-ping,QIAOMin-min,YUANYao-zong.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of connexin 43 (Cx43) in the apoptosis of pancreatic cancer cell line BxPC and its possible mechanism.MethodspcDNA-Cx43, pcDNA-Cx43N, pcDNA3.0, siRNA-Cx43 and siRNA-NC were transfected into BxPC3 cells via liposome method. Cx43 protein and Cytochrome C (Cyt C) concentration was determined by Western blot，and the apoptosis was analyzed by Annexin V/PI binding assay. The mitochondria apoptosis pathway involved in Cx43 associated apoptosis was examined which contains the depolarization of mitochondrial membrane potential (MMP); fluorospectrophotometer was used to measure the activities of caspase-3 and caspase-9. Gap junction intercellular communication(GJIC) was determined by dye-transfer method.ResultsCx43 protein expression increased after BxPC3 transfection, apoptosis rate increased from (6.35±0.43)% in empty vector transfection group to (14.29±1.24)%; after H2O2 treatment, apoptosis rate increased from (20.34±2.47)% to (31.27±2.56)% (Plt;0.05). Meanwhile, mitochondrial membrane potential was decreased, Cyt C was increasingly released from mitochondria, caspases activities were increased; after siRNA43 interference, apoptosis rate decreased from (7.42±0.47)% to (5.19±1.37)%, after H2O2treatment, apoptosis rate decreased from (19.43±1.71)% to (11.67±1.97)% (Plt;0.05). Decreased mitochondrial membrane potential and Cyt C

release were observed, caspases activities were decreased. GJIC of pcDNA-Cx 43 transfection group increased from 14.52±0.57 to 23.05±3.84, and it increased from 1.70±0.24 to 3.84±0.45 in the presence of β-GA (Plt;0.05). But the apoptosis rate was not significantly different.ConclusionsCx43 could promote BxPC3 apoptosis via mitochondrial apoptotic signal pathway, and the possible mechanism included signal pathway other than GJIC.

Pancreatic neoplasms; Connexin 43; Gap junction; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.009

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化科

袁耀宗，Email:yyz28@medmail.com.cn