蘇應(yīng)兵，楊代勤 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥的免疫預(yù)防研究

蘇應(yīng)兵，楊代勤 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

通過試驗(yàn)確定了嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)全菌苗的福爾馬林安全滅活濃度、最佳滅活溫度及時(shí)間，并選取最佳滅活方式，制備了全菌苗F-1、F-2和F-3。采用所得全菌苗免疫斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，測(cè)定了其對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫原性。經(jīng)注射接種28 d后，受免斑點(diǎn)叉尾鮰血清中凝集抗體效價(jià)都有顯著增加。受免斑點(diǎn)叉尾鮰血液白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果表明，3個(gè)免疫組的吞噬百分比和吞噬指數(shù)都顯著地高于對(duì)照組。這表明，采用福爾馬林滅活的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d內(nèi)刺激斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)；白細(xì)胞吞噬活性；免疫預(yù)防

隨著斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)養(yǎng)殖在全國(guó)各地的推廣，養(yǎng)殖產(chǎn)量大幅度提高，集約化生產(chǎn)能力加大。但其病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重，尤其是苗種培育階段和成魚的后期養(yǎng)殖，各種病原體侵襲引發(fā)斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)性死亡時(shí)有發(fā)生，極大地影響了斑點(diǎn)叉尾鮰的產(chǎn)量、效益，病害已成為影響斑點(diǎn)叉尾鮰規(guī)?；a(chǎn)的“瓶頸”因素之一。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖者普遍使用抗生素等化學(xué)藥物來控制，一方面使致病病原體的抗藥性不斷增加，使機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫功能下降[1]；另一方面，對(duì)環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重的污染和破壞，同時(shí)，藥物殘留還會(huì)對(duì)食用者構(gòu)成潛在的威脅[2]。隨著對(duì)綠色環(huán)保食品和環(huán)境保護(hù)的要求及免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已有通過接種疫苗進(jìn)行水生生物疾病控制的報(bào)道[3]。在我國(guó)，對(duì)疫苗免疫機(jī)理的研究多集中于血清抗體濃度和效價(jià)的提高等特異性體液免疫方面[4]。本研究通過確定嗜水氣單胞菌全菌苗的福爾馬林安全滅活濃度和最佳滅活溫度及時(shí)間，選取最佳滅活方式，制備嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌滅活全菌苗；同時(shí)，用全菌苗免疫斑點(diǎn)叉尾鮰后，分析其免疫指標(biāo)和疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的保護(hù)率，即凝集抗體效價(jià)、白細(xì)胞吞噬活性和免疫保護(hù)率，旨在探討采用滅活疫苗預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥的可能性，為斑點(diǎn)叉尾鮰的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于制備免疫原的菌株是從3種表現(xiàn)出血癥狀的患病斑點(diǎn)叉尾鮰中分離得到的3株致病病原菌，分別記為Jh-1、Jh-2和 Yh-3。經(jīng)分離、純化和鑒定，確定菌株Jh-1屬嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，菌株Jh-2和 Yh-3均屬溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(另文發(fā)表)。

吞噬實(shí)驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌(staphylococcusaurreus)由長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚病室提供。試驗(yàn)用健康斑點(diǎn)叉尾鮰取自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所良種繁育基地，體長(zhǎng)(16.5±1.0) cm，體重(39.0±0.5) g，暫養(yǎng)1周后備用。

1.2 免疫原的制備

將菌株Jh-1接種于普通蛋白胨牛肉膏液體培養(yǎng)基(pH7.2)，28 ℃恒溫?fù)u床(150 r/min )培養(yǎng)18 h后，平板法測(cè)定細(xì)菌濃度，用無菌生理鹽水(0.5%,W/V)稀釋至5.0 × 109cfu/mL后，分組分別加入終濃度為0%、0.1%、0.2%、0.4%的福爾馬林，置4、28、60 ℃分別滅活，按設(shè)定時(shí)間取出滅活的菌液在無菌條件下3 000 r/min，30 min離心，去上清，再加入等量0.5%(W/V)魚用生理鹽水，然后劃線接種于FWA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，從而檢測(cè)滅活效果，確定福爾馬林安全滅活濃度和最佳滅活溫度。選取最佳滅活方式分別滅活Jh-1、Jh-2、Yh-3 3株菌株，滅活完成后，即分別得到對(duì)應(yīng)的福爾馬林滅活的嗜水氣單胞菌(formalin killedA.hydrophila，F(xiàn)-1)和溫和氣單胞菌全菌苗(formalin killedA.sobria，F(xiàn)-2和F-3),置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌苗的安全性試驗(yàn)

選取健康斑點(diǎn)叉尾鮰，胸鰭基部注射按前面所制得的滅活全菌苗F-1、F-2和F-3，每種菌苗各注射10尾，注射劑量為0.2 mL/尾，對(duì)照組10尾，注射等量無菌生理鹽水(0.5%，W/V) ，飼養(yǎng)15 d，觀察并記錄斑點(diǎn)叉尾鮰的活動(dòng)情況。

1.4 金黃色葡萄球菌懸液的制備

將金黃葡萄球菌接種在液體肉湯培養(yǎng)基(上海生物制品廠出品)中，37 ℃下培養(yǎng)48 h，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37 ℃條件下滅活24 h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度稀釋至1.0×108cfu/mL，即為福爾馬林滅活的Staphylococussaurreus菌體(formalin killedS.aurreus，F(xiàn)-SA)，用作檢測(cè)白細(xì)胞吞噬活性。

1.5 免疫與采血

將健康斑點(diǎn)叉尾鮰分為3個(gè)免疫組和1個(gè)對(duì)照組，每組30尾，其中免疫組每尾從胸鰭基部注射0.2 mL菌濃度為1.0×108cfu/mL的滅活全菌苗；對(duì)照組每尾從胸鰭基部注射0.2 mL無菌生理鹽水(0.5%，W/V)。免疫后第28 d從各組中隨機(jī)取6尾魚，斷尾采血。將每尾魚的血液均分為2份，1份置常溫下凝血后分離血清，供檢測(cè)凝集抗體效價(jià)用；另1份以肝素(1%肝素鈉)抗凝，供分離白細(xì)胞測(cè)定其吞噬活性之用。

1.6 凝集抗體效價(jià)的測(cè)定

采用96孔血凝記數(shù)板進(jìn)行。反應(yīng)抗原為F-1、F-2和F-3菌苗。加樣后的血凝板首先在30 ℃條件下孵育1 h，然后置于4 ℃冰箱中，翌晨判定其結(jié)果。

1.7 白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定

在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mLF-SA，搖勻，在28 ℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動(dòng)1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片，每個(gè)樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色1 h，水洗風(fēng)干后，鏡檢，并依下式計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比(phagocytic percentage,PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index,PI)。

1.8 免疫保護(hù)率的測(cè)定

免疫后第28 d，每組各取斑點(diǎn)叉尾鮰20尾，用分離到的病原菌攻毒，病原菌濃度為1.0×108cfu/mL，每尾用量0.2 mL，飼養(yǎng)觀察14 d，統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，采用下式計(jì)算免疫保護(hù)率(relative percent survival,RPS)[5]。

免疫保護(hù)率(%)=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌福爾馬林滅活濃度和溫度

在嗜水氣單胞菌菌懸液中加入不同濃度的福爾馬林，并置于不同溫度條件下進(jìn)行滅活，不同濃度和溫度的滅活情況見表1。由表1可見，在60 ℃條件下，采用0.4%、0.2%、0.1%濃度的福爾馬林分別只需2 h及4 h即可使菌體細(xì)胞完全失活；而在28 ℃時(shí)，用此3種濃度的福爾馬林完全滅活菌體細(xì)胞的時(shí)間就延長(zhǎng)至24 h、48 h和72 h，4 ℃時(shí)則分別達(dá)到4 d、8 d和8 d以上。從抗原性的保護(hù)和滅活效果綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)中全菌苗的滅活選擇了0.2%福爾馬林，28 ℃滅活2 d。

表1 不同溫度和不同福爾馬林濃度對(duì)菌細(xì)胞的滅活效果Table 1 The detoxication effects of different formalin concentrations and temperatures on bacterial cell

注：+表示菌苗尚具活力，-表示菌苗完全失活。

表2 受免和對(duì)照斑點(diǎn)叉尾鮰血清中凝集抗體效價(jià)Table 2 Agglutinating antibody titre in the serum of immunized and control Ictalurus punctatus

注：括號(hào)中數(shù)字為幾何平均數(shù)。

表3 受免和對(duì)照斑點(diǎn)叉尾鮰血液白細(xì)胞對(duì)F-SA的吞噬活性Table 3 Phagocytic activity of blood leucocytes to formlin killed Staphylococcus aurreus of immunized and control Ictalurus punctatus

注：**表示與對(duì)照組差異極顯著， *表示與對(duì)照組差異顯著。

表4 活菌攻毒后斑點(diǎn)叉尾鮰的死亡率和免疫保護(hù)率Table 4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Ictalurus punctatus after challenged with live A.hydrophila and A. sobria

2.2 安全性試驗(yàn)結(jié)果

注射了滅活全菌苗的30尾斑點(diǎn)叉尾鮰經(jīng)過15 d飼養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)有死亡現(xiàn)象或染病癥狀，說明所用疫苗的注射劑量對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰是安全的。

2.3 凝集抗體效價(jià)

用F-1、F-2和F-3分別接種斑點(diǎn)叉尾鮰后28 d后，血清中凝集抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，3株菌苗注射接種斑點(diǎn)叉尾鮰28 d后，受免斑點(diǎn)叉尾鮰血清中凝集抗體效價(jià)均不同程度地上升，其中以F-1免疫組最高，平均為1∶60.8；F-2免疫組其次，平均為1∶48.0；凝集抗體效價(jià)最低的為F-3免疫組，平均僅為1∶30.4。而對(duì)照組血清的凝集抗體效價(jià)都很低，平均為1∶6.4。

2.4 血液中白細(xì)胞的吞噬活性

由表3可以看出，3株菌苗注射接種斑點(diǎn)叉尾鮰28 d后，受免斑點(diǎn)叉尾鮰血液中白細(xì)胞的PP，均極顯著地高于對(duì)照組(Plt;0.01)，PI也均顯著地高于對(duì)照組(Plt;0.05)； 其中F-1和F-2免疫組的白細(xì)胞的PP和PI極顯著地高于對(duì)照組(Plt;0.01)。

2.5 免疫保護(hù)率

由表4可以看出，斑點(diǎn)叉尾鮰對(duì)全菌苗F-1、F-2和F-3分別產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫保護(hù)，其免疫保護(hù)率分別為52.9%、47.1%和35.3%。

3 討論

滅活疫苗的制備，關(guān)鍵是確定適宜的滅活劑濃度，滅活溫度及滅活時(shí)間，這其中使病原菌完全滅活是第一重要的。陳月英等[6]在研究養(yǎng)殖魚類敗血癥的嗜水氣單胞菌苗時(shí)，認(rèn)為用0.15%～0.2%福爾馬林，4 ℃時(shí)只需1 d就可使菌細(xì)胞滅活。而本研究結(jié)果中，菌株Jh-1 4 ℃ 0.2%的福爾馬林至少需要8 d才能使其失活。形成以上差異的原因可能是由于菌株之間的個(gè)體差異或菌液濃度不同，但本研究結(jié)論與楊先樂等[5]認(rèn)為鱉嗜水氣單胞菌4 ℃ 0.2%的福爾馬林至少需要12 d才能使鱉嗜水氣單胞菌失活的結(jié)果較接近。

一般認(rèn)為，在使致病菌體足以滅活的各種方法中，較溫和的滅活條件，即較低的溫度與較低的福爾馬林濃度(或較短的福爾馬林作用時(shí)間)，能有效地保護(hù)滅活疫苗的免疫性抗原[6]，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。但是，楊先樂等[5]認(rèn)為，并不是所有較低滅活的溫度與較低的福爾馬林濃度對(duì)抗原的損失均較小，這一現(xiàn)象在對(duì)草魚出血病的細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究中也曾出現(xiàn)。因此，在本試驗(yàn)中全菌苗的滅活選擇了0.2%福爾馬林，28 ℃滅活2 d。但是，滅活條件對(duì)滅活疫苗免疫原性的影響是復(fù)雜的，只有找出它們之間的相互關(guān)系，才能制造出高效價(jià)的滅活疫苗，這需要今后進(jìn)一步研究探索。

硬骨魚類的吞噬細(xì)胞及其構(gòu)成的單核巨噬系統(tǒng)是魚類捕捉抗原和清除病原微生物的重要防御系統(tǒng)[7]。一般認(rèn)為，動(dòng)物體內(nèi)的吞噬細(xì)胞可吞噬進(jìn)入體內(nèi)的異物，在動(dòng)物體的非特異性免疫中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等都與機(jī)體的抗感染免疫有密切聯(lián)系，其中的嗜中性顆粒白細(xì)胞和單核細(xì)胞等對(duì)入侵的病原微生物具有吞噬和殺滅作用，對(duì)保持機(jī)體生理狀態(tài)穩(wěn)定和免疫保護(hù)是非常重要的[8]。魚類的嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞已經(jīng)被證明具有較強(qiáng)的吞噬能力，這種能力對(duì)于特異性免疫機(jī)能相對(duì)于高等脊椎動(dòng)物來說比較低下的魚類而言，具有更為重要的意義。因此，通過測(cè)定血液中白細(xì)胞的吞噬功能，可以反映機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)[9]。免疫原性是抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性。Estevez等[10]報(bào)道了通過檢測(cè)血清凝集抗體效價(jià)來評(píng)價(jià)受免魚的體液免疫應(yīng)答水平；陳昌福等[11]通過檢測(cè)受免魚的血液白細(xì)胞的吞噬活性來評(píng)價(jià)受免魚的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。因此，通過檢測(cè)受免魚血清凝集抗體效價(jià)和血液中白細(xì)胞的吞噬活性來考察抗原的免疫原性是合理的。

從本研究結(jié)果可以看出，用福爾馬林滅活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，經(jīng)注射接種斑點(diǎn)叉尾鮰28 d后，受免斑點(diǎn)叉尾鮰血清中凝集抗體效價(jià)都有顯著增加。對(duì)受免和對(duì)照斑點(diǎn)叉尾鮰血液白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果表明，3個(gè)免疫組的PP和PI都顯著地高于對(duì)照組。這表明，用福爾馬林滅活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d內(nèi)刺激斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)生較強(qiáng)的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。

本研究結(jié)果顯示,對(duì)受免斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行活菌攻毒后,斑點(diǎn)叉尾鮰對(duì)全菌苗F-1、F-2和F-3分別產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫保護(hù)，但免疫保護(hù)率均偏低，分別為52.9%、47.1%和35.3%，這可能因?yàn)橹贿M(jìn)行了1 次免疫，如再次免疫，很可能會(huì)提高免疫力，這有待于進(jìn)一步探討。另外，由于氣單胞菌抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，全菌苗免疫效果可能會(huì)受到限制，而其致病因子的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，因此，可考慮從氣單胞菌的致病因子著手，尋找共同的保護(hù)性抗原，以研制更有效的疫苗。

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S942.5

A

1673-1409(2009)02-S032-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.011

2009-06-05

蘇應(yīng)兵(1978-)，男，湖北天門人，農(nóng)學(xué)碩士，助教，主要從事水生動(dòng)物疾病學(xué)研究.