陳軍寧 尹友生 李小勵(lì) 韋家智 鄧一嵐 蘇 珂

摘要: 目的:探討白細(xì)胞介素-6(IL-6)基因啟動(dòng)子-572 C/G多態(tài)性各等位基因及基因 型在2型糖尿病腎病患者中的分布頻率,并分析其基因型與2型糖尿病腎病的相關(guān)性。方法: 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)183例2型糖尿病腎病患者 ( 其中91例伴糖尿病腎病)及105例正常對(duì)照組IL-6基因多態(tài)性,包括IL-6基因啟動(dòng)子- 5 72C/G位點(diǎn),同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-6水平。結(jié)果:糖尿病腎病 組 IL-6血清水平顯著高于糖尿病不伴腎病組和對(duì)照組(P<0.01),IL-6基因多態(tài)性在兩 組人群 中的分布差異存在顯著性差異(P<0.05),等位基因頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn),G等位 基因攜帶 者患糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因的1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), 攜帶G 等位基因的糖尿病腎病患者IL-6血清水平顯著高于不攜帶者(361.71±93.42 pg/ml VS343 .03±86.54 pg/ml, P<0.05)。結(jié)論:IL-6基因啟動(dòng)子-572 C/G多態(tài)性與糖尿病 腎病的 發(fā)病具有相關(guān)性,其中G等位基因可能是糖尿病腎病發(fā)病的遺傳易感基因,攜帶G等位基因的 個(gè)體可能通過(guò)促進(jìn)IL-6的高度表達(dá)進(jìn)而增加2型糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞:白細(xì)胞介素-6; 糖尿病腎病;基因型

中圖分類號(hào): R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1008-2409(2009)05-0801-04

The genotype ofIL-6 gene in patients with type 2 diabetic nephropathy/CHEN Ju n-ning, YIN You-sheng, LI Xiao-li,et al.∥Department of Emergency, The Affil iated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Abstract:Objective: To study the relationship the allele frequencies andgenotype distribution of interleukin(IL-6)gene promoter -572C/G polymorphismi n Chinese patients with type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy(DN),A nd analyze association the serum levels and genotype of IL-6 with type 2 diab e tic nephropathy.Methods: The IL-6 gene promoter -572C/G polymorphism were det e cted by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR - RFLP)analysis among 183 patients with type 2 diabetes mellitus and 105 healthycontrols. The serum level of IL-6 was determined by enzyme-linked immunos or bent assay(ELISA). Results: The diabetic nephropathy group showed significantlyhigher serum levels of IL-6 than that of control group(P<0.01). There was s ignificant di fference in frequencies of allele and genotype in -572C/G polymorphism between t ype 2 diabetic nephropathy group and control groups, respectively. The relativerisk suffered from type 2 diabetic nephropathyofGallele was 1.618 times of t he C allele(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), the serum IL-6 level was signific a ntly higher among carriers of G allele as compared with non-carriers(C allele)( 361.71±93.42 pg/ml VS 343.03±86.54 pg/ml, P<0.05). Conclusion: IL-6 genepromo ter -572C/G polymorphism was associated with type 2 diabetic nephropathy, and Gallele may be a genetic risk factor of type 2 diabetic nephropathy. In which theIL-6 G allele carriers may be increase risk by enhancing the IL-6 expressionin the pathogenesis oftype 2 diabetic nephropathy.

Key words:interleukin-6; diabetic nephropathy; genotype

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一, 是嚴(yán)重危害中?老年人生命健康的疾病。然其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但細(xì)胞因子在 其中的作用越來(lái)越受到重視。白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一種具有多種功 能 的炎癥細(xì)胞因子,它與血脂代謝紊亂?凝血機(jī)制異常?動(dòng)脈粥樣硬化形成等糖尿病腎病危險(xiǎn) 因素密切相關(guān)。IL-6基因存在著基因變異及基因多態(tài)性,這種基因多態(tài)性與多種疾病存在 相 關(guān)性[1-3],與糖尿病腎病是否相關(guān),文獻(xiàn)報(bào)道較少[4,5]。為此, 筆者應(yīng)用聚合酶鏈反 應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法,研究IL-6基因啟動(dòng)子-572 C/G多態(tài)性及血 清水 平與糖尿病腎病的關(guān)系,闡明基因型與表型之間的聯(lián)系,為認(rèn)識(shí)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供 一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 2型糖尿病(T2DM)組 共183例,男82例,女101例;平均年齡( 52.7±10.1)歲。均符 合1997年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)。分為糖尿病腎病(DN)組91例,男40例,女51例, 年齡(57.59±9.72)歲,平均病程(86.85±79.66)月;入選條件:①至少2 次尿白蛋白排泄 率(UAER)>30 mg/24 h;②尿蛋白定量>0.5g/24 h;③血肌酐>167μmol/ L。有上述條件之 一,并排除其他疾病引起的蛋白尿和腎功能不全。糖尿病不伴腎病(DM)組92例,男42例,女 50例,年齡(56.72±9.98)歲,平均病程(82.15±50.85)月;入選條件為3次UAER<30 mg/24 h。

1.1.2 健康對(duì)照(HC)組 共105例,男50例,女55例;年齡(54.27±10. 13)歲,為健康體檢 者,排除了糖尿病?高血壓?冠心病和肥胖及相應(yīng)疾病的家族史。以上全部研究對(duì)象均來(lái)自 廣西桂北地區(qū)漢族人群,且無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物[6],由北京 賽百盛有限公司合成。用 于特異性擴(kuò)增IL-6基因包含-572位點(diǎn)的一段DNA引物序列,上游引物為:5-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3;下游引物為:5-GAGTTTCCTCTGACTC CATCGCAG-3。

1.2.2 人類基因組DNA提取 參照已建立的改良碘化鈉法。取全血200μl加 無(wú)菌雙蒸水100μ l混勻,加6mol/L碘化鈉 200μl 顛倒混勻2 min(勿震蕩),加等體積氯仿/異戊醇(24:1 ) 混勻,漩渦震蕩3 min,15000rpm離心15 min,取上清液加240μl 純異丙醇混勻,室溫(或 4℃)靜置15 min,15000rpm離心15 min,棄上清,沉淀用37%異丙醇或70%乙醇洗滌3次,自 然晾干,加50μl TE緩沖液溶解,經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)基因擴(kuò)增 IL-6的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl,其中含 10×PCR Buffer 2 .5μl,2.5mmol/LdNTPs2.0μl,引物P1?P2各20pmol,模板DNA 5.0μl,TaqDNA聚合酶1 .25U,不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μl。置熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 2700型)中94 ℃預(yù) 變性5min;再按下列程序循環(huán)35次,即94℃變性45s,57℃退火1min,72℃延伸1min; 末次循環(huán)后,72℃延伸5min。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl,8U MbiⅠ于37℃酶 切3 h(英國(guó)Biolab s公司)酶切IL-6基因-572位點(diǎn),反應(yīng)終止后,消化片段在3%瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色 ,染色后經(jīng)紫外燈判斷結(jié)果并拍照。

1.2.5 血脂?脂蛋白及載脂蛋白水平測(cè)定 酶法測(cè)定血清總膽固醇和甘油 三酯;遮蔽法直接 測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C);apoA?apoB用雙波長(zhǎng)免 疫 透射比濁法測(cè)定。以上測(cè)定均在日立7060型(日本產(chǎn))全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行,每次測(cè)定均 選用高?中?低3種質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)控,以上項(xiàng)目檢測(cè)質(zhì)控均符合英國(guó)RIQAS國(guó)際質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 血清IL-6水平的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定IL-6血清水平 (VIDAS型酶標(biāo)儀),試劑盒由美國(guó)GeneMay公司提供,每次測(cè)定均嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析。基因型和等位基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算,各組 間 基因型及等位基因頻率比較采用χ²檢驗(yàn),并以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示 相 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。計(jì)量資料用(±s)表示,各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì), 用t檢驗(yàn)?方差分析。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6基因型分析

IL-6 基因-572 C/G多態(tài)性,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為163 bp,根據(jù)限 制性內(nèi)切酶MbiⅠ酶切片段的情況,本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)的基因型有3種,CC型(163bp 1條帶), CG型(163 bp,101bp,62bp 3條帶),GG型(101bp,62bp 2條帶)。

2.2 糖尿病腎病組?糖尿病不伴腎病組與對(duì)照組臨床資料比較

3組在性別和年齡上進(jìn)行了 匹配。糖尿病腎病組TC?TG?和IL-6水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01);SBP(收縮壓 )?D BP(舒張壓)?HDL-C?LDL-C?apoA?apoB在各組間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05), 見(jiàn)表1。

2.3 糖尿病腎病組?糖尿病不伴腎病組及正常對(duì)照組IL-6基因型和等位基因頻率分布

糖尿 病腎病組IL-6(-572 C/G)基因CC型?CG型及GG型頻率分布與正常對(duì)照組及糖尿病不伴腎 病 組比較差異均有顯著意義(分別為χ²1=6.235,P<0.05;χ²2=6.528,P< 0.05)。糖尿病腎病組G 等位基因頻率為60.4%,亦與正常對(duì)照組及糖尿病不伴腎病組分布差異有顯著意義(χ²1=5. 530,P<0.05;χ²2=5.862,P<0.05),與對(duì)照組比較,攜帶G等位基因的個(gè)體 患糖尿病腎病的 相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度增加1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418)。而不伴腎病組與正常對(duì)照組 相比,其基因型頻率和等位基因頻率差異均無(wú)顯著性(P>0.05),見(jiàn)表2。

2.4 糖尿病腎病組和對(duì)照組IL-6各基因型間血脂?IL-6血清水平比較

2型糖尿病腎病組和對(duì) 照組中CG+GG基因型血清IL-6?UC水平顯著高于CC基因型(P<0.05),見(jiàn)表3。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)而又嚴(yán)重的并發(fā)癥,預(yù)后較差,發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。大量研究 證明,遺傳因素?糖與脂質(zhì)代謝紊亂?血流動(dòng)力學(xué)?細(xì)胞因子等“共同土壤”的長(zhǎng)期作用是 引起糖尿病腎病發(fā)生的主要原因。

正常腎組織表達(dá)的某些因子對(duì)維持腎臟的結(jié)構(gòu)和功能起著十分重要的作用。病理情況下 ,在某些刺激因素作用下,部分細(xì)胞因子使腎小球病理變化加劇,引起腎小球組織結(jié)構(gòu)和功 能的異常[7]。病理方面表現(xiàn)為誘發(fā)和加重腎小球增生?肥大,基質(zhì)蛋白沉積,系 膜區(qū)擴(kuò)展 ,基膜增厚,呈現(xiàn)糖尿病典型的腎小球硬化征。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子,由T細(xì)胞? 巨噬細(xì)胞?成纖維細(xì)胞?上皮細(xì)胞自發(fā)或誘發(fā)產(chǎn)生。IL-6可以通過(guò)釋放繼發(fā)性細(xì)胞因子或 活 化宿主細(xì)胞免疫直接或間接實(shí)現(xiàn)其效應(yīng),在免疫系統(tǒng)?造血系統(tǒng)?神經(jīng)系統(tǒng)?肝臟代謝中均 起重要作用。其在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中所起的作用已引起人們廣泛重視。IL-6可促進(jìn)T? β細(xì)胞過(guò)度激活和擴(kuò)增,加速細(xì)胞凋亡,促進(jìn)胰島β細(xì)胞的破壞[8,9],促進(jìn)腎臟 系膜增殖 。由此可見(jiàn),IL-6可通過(guò)多途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能,造成胰島及腎臟病理?yè)p傷。IL-6 基 因 位于第7號(hào)染色體短臂上,含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,在基因啟動(dòng)子區(qū)存在-572C/G多態(tài)性 ,這種基因多態(tài)性可影響IL-6基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并影響IL-6相關(guān)疾病的發(fā)生?發(fā)展和轉(zhuǎn)歸 。 由于IL-6在糖尿病腎病發(fā)病中有重要作用,IL-6基因與糖尿病腎病關(guān)系也得到人們的關(guān)注 , 但I(xiàn)L-6基因啟動(dòng)子區(qū)-572C/G多態(tài)性與糖尿病腎病之間是否存在相關(guān)性,是否通過(guò)影響血脂 代謝?IL-6的表達(dá)而影響糖尿病腎病的病程等等,目前尚不清楚。為┟魅藩狪L-6基因多 態(tài)性與 糖尿病腎病的關(guān)系,筆者通過(guò)對(duì)91例糖尿病腎病患者及92例糖尿病不伴腎病患者和105名正 常人IL-6基因多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者IL-6基因-572C/G多態(tài)性分布與糖尿病不 伴 腎病組和正常人比較差異具有顯著性(P<0.05),其中攜帶G等位基因個(gè)體患糖尿病腎 病的 風(fēng)險(xiǎn)約是C等位基因的1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), 提示G等位基因可能是 糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素之一。為了進(jìn)一步探討IL-6基因多態(tài)性與其血清水平的關(guān)系,筆者 檢 測(cè)了糖尿病腎病患者及糖尿病不伴腎病患者和健康對(duì)照者IL-6血清水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病 腎 病患者及糖尿病不伴腎病患者IL-6血清水平顯著高于健康對(duì)照者。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)IL-6 基 因 -572C/G多態(tài)性可影響其血清水平,攜帶G基因型的糖尿病腎病患者血清IL-6水平顯著高于 不 攜帶者(P<0.05),故認(rèn)為:在病理?xiàng)l件下,攜帶G基因型的個(gè)體可促進(jìn)IL-6的高度表 達(dá)而增加糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,糖尿病腎病是一種多因素參與的常見(jiàn)病,除環(huán)境因素影響之外,遺傳因素 在其中也起著更為重要的作用,通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)-572C/G多 態(tài) 性與2型糖尿病腎病具有相關(guān)性,其中G等位基因可能是2型糖尿病腎病的遺傳易感基因,攜 帶G等位基因的個(gè)體可促進(jìn)血清TC?IL-6的高度表達(dá)進(jìn)而增加2型糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 但I(xiàn)L-6基因多態(tài)性在2型糖尿病腎病發(fā)病中的確切機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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(收稿日期: 2009-08-02)

[責(zé)任編輯 王慧瑾 鄧德靈]