林久茂 彭 軍 魏麗慧 徐 偉

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白花蛇舌草提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

林久茂1,2彭 軍1,2魏麗慧1,2徐 偉3

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 2.福建中西醫(yī)結(jié)合研究院 3. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

結(jié)直腸癌（CRC）是危害人類健康的主要腫瘤之一，在美國(guó)的各種腫瘤中位列第三[1]。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2007年估計(jì)在15多萬CRC的新病例中就有5萬多人死于CRC[1,2]。雖然一直以來歐美發(fā)達(dá)國(guó)家是結(jié)腸癌的高發(fā)地區(qū)，但近些年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式特別是飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著國(guó)人的生命和健康[3]。近年來隨著對(duì)結(jié)腸癌認(rèn)識(shí)的加深，在治療方面有了較大的發(fā)展，但是至今尚未發(fā)現(xiàn)有效的藥物治療手段。白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草[Willd.[Oldenlandia diffusa （Willd.） Roxb.]的全草，始載于《廣西植物志》，味苦、淡，性寒，無毒，歸胃、大腸、小腸經(jīng)。其主要功效是清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕，廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤。但白花蛇舌草的抗腫瘤分子作用機(jī)制尚未完全闡明，并根據(jù)白花蛇舌草中醫(yī)的歸大腸經(jīng)理論，故就白花蛇舌草對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物的制備

白花蛇舌草購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂醫(yī)院，批號(hào)：09072201。白花蛇舌草全草，用10倍85%乙醇回流提取2次，合并后過濾，回收乙醇，濾液濃縮至相對(duì)密度1.05，經(jīng)噴霧干燥得粉末。得到得提取物用40%DMSO溶解，配制成0.4g/mL溶液，經(jīng)高壓滅菌后于4℃保存待用。

1.1.2細(xì)胞株

結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)，中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(trypsin)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)干粉，Sigma公司；RT試劑盒、Trizol、PCR試劑盒，Promega公司；Taq聚合酶、Rnase inhibitor，TaKaRa公司；引物由上海英俊生物有限公司合成。

1.1.4儀器

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DLSB-5/20低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；B-290型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)，瑞士Buchi公司；ELX800酶標(biāo)儀，BioTek公司；HF212UV二氧化碳培養(yǎng)箱，Heal Force；IX70熒光倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS；GST-1型PCR儀，英國(guó)GSTORM公司；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DU-650型蛋白核酸分析儀，，美國(guó)Beckman公司；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于含10％熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％ CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。以RPMI1640培養(yǎng)液（含10%FBS）制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100uL，常規(guī)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。細(xì)胞分為4組，白花蛇舌草給藥濃度分別為0mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL，以上各組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸棄各孔中的液體，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液100uL，37℃孵育4h，然后吸棄各孔中的液體，加入DMSO 100uL/孔，振蕩混勻，室溫放置10min，使結(jié)晶充分溶解并混勻，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570nm測(cè)定各組吸光度值(即A值)，并按下列公式計(jì)算增殖抑制率：抑制率(%)=(對(duì)照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

HT-29細(xì)胞用白花蛇舌草提取物培養(yǎng)24h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)Bc1-2和Bax mRNA表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞胰酶消化后，取2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于6孔板，24h后進(jìn)行藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取上述細(xì)胞提取總的RNA，總RNA的提取參照Trizol試劑(Invitrigen公司)說明書進(jìn)行操作。取總RNA 1μg，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20μl體系)：cDNA 1μl，10×Taq Buffer 2ul，25mM MgCl21.2μl，10mM dNTP 0.4μl，1U/ul Taq酶0.8μl，上下游引物各1μl，加DEPC水至20μl，震蕩混勻，高速離心10s后，置PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，X℃退火40s,72℃延伸40s,持續(xù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。按說明書進(jìn)行操作。PCR 產(chǎn)物經(jīng)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后進(jìn)行光密度掃描，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，各基因的擴(kuò)增條帶的光密度值與各自內(nèi)參的光密度值之比作為衡量參數(shù)，Quantity one 軟件分析。具體的退火溫度及引物序列見表 1。

表1 PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.5Western Blot法檢測(cè)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

HT-29細(xì)胞按2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔板中，每孔用2ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，分別用不同濃度的白花蛇舌草提取物處理，處理24h后的細(xì)胞用裂解液抽提。含有等量蛋白的細(xì)胞裂解液用樣品緩沖液溶解后，將細(xì)胞的蛋白樣品定量，變性；進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜；脫脂牛奶封閉2h；洗膜，加入Bcl-2和Bax (稀釋倍數(shù)1：1000)的一抗以及β-actin(稀釋倍數(shù)1：1000)作為陽(yáng)性對(duì)照，在4℃震蕩過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1：25000)后，室溫孵育1h，然后用含0.25 % tween-20的TBS洗膜，加入1：1的ECL發(fā)光液，在25℃溫育5min，立即曝光，等條帶清晰后將膠片取出，用凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草提取物對(duì)HT-29增殖的抑制作用

白花蛇舌草提取物濃度達(dá)到1mg/mL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖有明顯的抑制作用(<0.01)，隨著藥物濃度的升高對(duì)HT-29的抑制率也升高，呈現(xiàn)劑量依賴。同時(shí)，各組間的比較也有顯著性差異(<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 白花蛇舌草提取物對(duì)HT-29增殖的影響(±s，n=8)

注：與對(duì)照組比較，1)<0.01

2.2 白花蛇舌草提取物對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察，空白組HT-29細(xì)胞胞質(zhì)均勻，核仁清楚，伸展性好，生長(zhǎng)良好，形成貼壁的梭形細(xì)胞。隨著白花蛇舌草提取物作用濃度的增加，可觀察到細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞多呈圓形，體積縮小，折光性差，細(xì)胞懸浮、脫落而死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白花蛇舌草提取物能夠抑制HT-29細(xì)胞的增殖，并隨濃度的增加而增強(qiáng)，呈明顯的量效趨勢(shì)。結(jié)果見圖1。

圖1 白花蛇舌草對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 HT-29細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)

HT-29細(xì)胞經(jīng)不同濃度白花蛇舌草提取物處理24h后，Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)隨濃度增加而減少，Bax mRNA和的蛋白的表達(dá)隨濃度增加而增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。結(jié)果見圖2。

(注：a. mRNA表達(dá)；b.蛋白表達(dá))

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的生命。雖然以外科手術(shù)為主的綜合治療有很大的提高，但其5年生存率仍然不高，尤其是中晚期患者目前仍缺少有效的治療方法。因此，尋求新的有效的輔助防治方法和有效的治療藥物已成為腫瘤研究工作者面臨的重要任務(wù)之一。而天然藥物治療各種腫瘤的副作用相對(duì)較少，因此，從天然藥物中尋找有效的抗腫瘤治療藥物成為了當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

細(xì)胞過度增殖與細(xì)胞凋亡失調(diào)是各種腫瘤發(fā)生的最主要原因。細(xì)胞凋亡是一種自主性的程序死亡過程，并對(duì)維持生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用。腫瘤細(xì)胞的凋亡與化療、放療以及治療藥物的敏感性密切相關(guān)，因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡是抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞凋亡是復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到一系列的基因調(diào)控，其中Bcl-2是參與凋亡調(diào)控的基因家族。Bcl-2和Bax是凋亡家族的重要成員，在凋亡調(diào)控中起著重要作用。Bcl-2在線粒體上可調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，以阻止細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)而抑制細(xì)胞凋亡；Bax可直接結(jié)合到線粒體膜上，改變膜的通透性，引起細(xì)胞色素C釋放入胞漿，激活Caspase家族引起凋亡[4]。Bax可與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此Bax與Bcl-2二者之間的比例對(duì)細(xì)胞的凋亡調(diào)控起著決定性作用。

白花蛇舌草具有清熱解毒、活血化淤等功效，目前廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療，并在對(duì)消化、呼吸、血液等系統(tǒng)的惡性腫瘤治療中取得了較好的療效。現(xiàn)代研究表明[5-7]，其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等，這些主要的有效成分具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性。臨床應(yīng)用報(bào)道也顯示白花蛇舌草對(duì)結(jié)腸癌術(shù)后的輔助治療有顯著的療效[8,9]。故本研究應(yīng)用白花蛇舌草進(jìn)行抗結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的研究。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的HT-29經(jīng)不同濃度（1、3、5mg/ml）的白花蛇舌草作用24h后，經(jīng)MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示隨著白花蛇舌草提取物給藥劑量的增加對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用也隨之增強(qiáng)，并且在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)貼壁細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變圓，由貼壁而脫落，浮懸于培養(yǎng)液中；白花蛇舌草提取物對(duì)HT-29細(xì)胞Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用，明顯上調(diào)Bax的mRNA與蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明白花蛇舌草可能是通過抑制Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)Bax的表達(dá)誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，具有顯著的量效關(guān)系。本研究為臨床應(yīng)用白花蛇舌草治療結(jié)腸癌提供了理論依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)中所用的白花蛇舌草為白花蛇舌草乙醇提取物，白花蛇舌草提取物是一種混合物，其抗腫瘤作用活性成分和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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