孟凡杰(農(nóng)村成人高等專(zhuān)科學(xué)校,吉林 梨樹(shù) 136500)
虎奶菇[Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing]又名核耳菇,隸屬側(cè)耳科的菌核,生于森林內(nèi)土中的腐木或木樁上,是產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一種珍稀食藥用菌,我國(guó)云南省滕沖、章風(fēng)一帶有分布,滇西南一帶民間多從緬甸進(jìn)口,資源十分緊缺。據(jù)《中藥藥名辭典》載:虎奶菌,甘,溫,補(bǔ)氣益血,治氣血虛弱癥。在東南亞國(guó)家華僑中及我國(guó)沿海地區(qū),虎奶主要作為強(qiáng)壯補(bǔ)品食用,在一些民間處方中,為一味止咳平喘中藥。但虎奶菌作為一種中藥材在我國(guó)藥典和各地地方標(biāo)準(zhǔn)中并未被收載;目前在非洲的尼日利亞、加納、肯尼亞等正在引種栽培。福建三明也成功地引種栽培。據(jù)報(bào)道虎奶菇富含蛋白質(zhì)、多糖等活性物質(zhì)和鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。非洲一些國(guó)家用虎奶菇治療胃病、糖尿病、冠心病、高血壓等疾病;虎奶菇還能促進(jìn)胎兒發(fā)育,提高早產(chǎn)兒成活率;東南亞各國(guó)用虎奶菇菌核治療痢疾。據(jù)報(bào)道,虎奶菇菌核入藥,外敷有治療婦女乳腺炎之效。迄今我國(guó)尚未開(kāi)發(fā)利用。由于虎奶菇人工栽培周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、成本高,為了開(kāi)發(fā)利用虎奶菇資源,從國(guó)外引種進(jìn)行栽培和發(fā)酵培養(yǎng)的深入研究是十分必要的。已知從各種真菌中分離出具有生物活性的物質(zhì)常為多糖[1-7]、靈芝多糖、灰樹(shù)花多糖等已用于腫瘤的臨床治療。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在虎奶菌核中多糖為其主要成分,占菌核干重的60%[8]。本文就虎奶菇菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。
1.1 材料
1.1.1 菌種
虎奶菇:購(gòu)于山東濟(jì)寧光大食用菌科研中心。
1.1.2 碳源
葡萄糖,果糖,木糖,麥芽糖,乳糖,蔗糖,玉米淀粉,馬鈴薯,糊精。
1.1.3 氮源
酵母膏,牛肉膏,蛋白胨,豆粕粉,麩皮。
1.2 主要儀器設(shè)備
回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床柜(無(wú)錫查橋輕機(jī)廠);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);
立式圓形壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠);
80-2型離心機(jī)(上海器械廠)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 培養(yǎng)基的配制
斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20g(煮沸20min過(guò)濾取濾液)、葡萄糖2g、瓊脂2g、水100g、pH值自然。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯250g(切碎煮沸30min,用4層紗布過(guò)濾,取濾液),蔗糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,KH2PO41g,MgSO40.6g,水1000g,pH值自然。
1.3.2 培養(yǎng)方法
平皿培養(yǎng):從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于培養(yǎng)皿的中部,于25℃培養(yǎng)7d。
液體種子培養(yǎng):將已活化的平板菌定量接種于液體種子培養(yǎng)基中,500mL三角瓶裝培養(yǎng)基50mL,于25℃,150r/min搖瓶培養(yǎng)7d。
搖瓶條件實(shí)驗(yàn):在發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中接入液體種子,變化相應(yīng)搖瓶條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別測(cè)定菌體干重與胞外多糖量。
1.3.3 測(cè)定方法
菌體干重(Wd):所得發(fā)酵液于3000r/min離心20min,去離子水洗滌后用sartrius自動(dòng)水分干燥儀干燥至恒重。
總糖(Wts):苯酚-硫酸法
胞外多糖(Wl):發(fā)酵濾液多糖
由于虎奶菇在我國(guó)產(chǎn)量較少,引種栽培也剛剛起步,液體深層發(fā)酵培養(yǎng)更不成型,買(mǎi)的這株菌常規(guī)培養(yǎng)下產(chǎn)量就很不穩(wěn)定,因此需要進(jìn)行簡(jiǎn)單優(yōu)化。
2.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響
圖1 不同碳源菌體干重和多糖含量
虎奶菇作為一種擔(dān)子菌,它對(duì)碳源的利用也應(yīng)該相當(dāng)廣泛,但是不同的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響會(huì)很大。葡萄糖、果糖、麥芽糖和糊精等都是虎奶菇菌絲體較為理想的碳源,尤其以馬鈴薯和蔗糖為最佳,虎奶菇菌絲體在果糖中比在葡萄糖中生長(zhǎng)要好,說(shuō)明酮糖比醛糖更容易被虎奶菇菌絲體利用,這一結(jié)論也可以從蔗糖、麥芽糖的結(jié)果差異上得到證明,麥芽糖是以兩個(gè)葡萄糖為單位連接而成的雙糖,蔗糖則為葡萄糖和果糖組成的雙糖,結(jié)果虎奶菇菌絲體在以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)量和多糖產(chǎn)量都高于麥芽糖。因此,綜合考慮采用蔗糖和馬鈴薯組成的復(fù)合碳源。
2.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的影響
由于擔(dān)子菌使用無(wú)機(jī)氮作為氮源時(shí),菌絲必須利用無(wú)機(jī)氮合成其需要的各種氨基酸,而某些氨基酸可能不能被菌體生物合成,從而影響菌絲的生長(zhǎng)[22]。因此作者沒(méi)有選用無(wú)機(jī)氮,只選擇酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉和麩皮。結(jié)果表明除豆粕粉以外,其他四種氮源差別不大,用酵母膏時(shí)多糖產(chǎn)量略高一些,為0.521mg/mL,而用蛋白胨時(shí)菌體量略高一些,為1.003g/100mL,因此選用酵母膏和蛋白胨作為復(fù)合氮源較理想。使用豆粕粉為氮源時(shí),產(chǎn)量非常低,這是作者沒(méi)有想到的。
2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組成
以上單因子實(shí)驗(yàn)表明,蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨是影響虎奶菇菌絲生長(zhǎng)和多糖產(chǎn)量的主要營(yíng)養(yǎng)因子。為考慮多因子的協(xié)同作用,并確定最適用量和配比,以得到經(jīng)濟(jì)有效的虎奶菇菌絲體培養(yǎng)基組成,選用蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨等四因子,各取三水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9(34)
極差分析表明,各因素對(duì)虎奶菇菌絲體干重的影響程度為:A>B>C=D,也就是說(shuō)蔗糖是菌絲體生長(zhǎng)的最主要因素(R=0.099),菌絲體生長(zhǎng)理論上的最優(yōu)組合為A3B1C1D2,即蔗糖3g/100mL,馬鈴薯20g/100mL,蛋白胨0.2g/100mL,酵母膏0.2g/100mL。對(duì)胞外多糖影響的最優(yōu)組合為A2B3C2D2,即蔗糖2g/100mL,馬鈴薯25g/100mL,蛋白胨0.2g/100mL,酵母膏0.2g/100mL。
由于培養(yǎng)虎奶菇菌絲體的目的為產(chǎn)多糖,結(jié)合投入與產(chǎn)出比,選擇碳氮源的配比為:蔗糖2g/100mL,馬鈴薯25g/100mL,蛋白胨0.2g/100mL,酵母膏0.2g/100mL。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析
虎奶菇多糖深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成(g/L)為∶蔗糖2g/100mL,馬鈴薯25g/100mL,蛋白胨0.2g/100mL,酵母膏0.2g/100mL。在此條件下發(fā)酵產(chǎn)虎奶菇胞外多糖達(dá)0.5mg/100mL以上。
[1]Bao X F,Wang X S,Dong Q,et al.Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum[J].Phytochemistry,2002,59(2):175-181.
[2]Shaunak S,Gooderham N J,Eduards R J,et al.Infection by HIV-1 blocked by binding of dextrin 2-sulfate to the cell surface of activated human peripheral blood mononuclear cells and cultured T-cells[J].Br J Pharmacol,1994,(13):151-158.
[3]Harada N,Kodama N,Nanba H.Relationship between dendritic cells and the D-fraction induced TH-1 dominant response in BALB/c tumor-bearing mice[J].Cancer Lett,2003,192(2):181-187.
[4]Kodama N,Komuta K,Sakai N,et al.Effects of DFraction,a polysaccharide from Grifola frondosa on tumor growth involve activation of NK cells[J].Biol Pharm Bull,2002,25(12):1647-1650.
[5]Inoue A,Kodama N,Nanba H.Effect of maitake(Grifola frondosa)D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J].Biol Pharm Bull,2002,25(4):536-540.
[6]Wang Y Y,Khoo K H,Chen S T,et al.Studies on the immuno-modulating and antitumor activities of Ganoderma lucidum(Reishi)polysaccharides:functional and proteomic analyses of a fucose-containing glycoprotein fraction responsible for the activities[J].Bioorg Med Chem,2002,10(4):1057-1062.
[7]MatsuiK,KodamaN,NanbaH.Effects of maitake(Grifola frondosa)D-Fraction on the carcinoma angiogenesis[J].Cancer Lett,2001,172(2):193-198.
[8]鄧成華,楊祥良,顧小曼,等.虎奶菌多糖的分離純化及成分分析[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2000,35(2):296-298.
[9]肖光輝,吳德喜,李青.喉頭菌對(duì)碳氮營(yíng)養(yǎng)的利用[J].食用菌學(xué)報(bào),1995,2(2):27-32.