李學(xué)琳,高學(xué)軍,盧志勇,駱超超,劉曉飛,敖金霞

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

L-賴氨酸是動(dòng)物的“第一限制性必需氨基酸”[1],對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡,提高體內(nèi)對(duì)谷類(lèi)蛋白質(zhì)的吸收,改善動(dòng)物營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育均有重要作用[2]。由于大多數(shù)植物蛋白質(zhì)中賴氨酸含量偏低,以致動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用率偏低,若在飼料中添加適量的賴氨酸,可提高蛋白質(zhì)的利用率。賴氨酸作為重要的飼料添加劑,應(yīng)用量很大。在玉米籽粒加工、配制混合飼料的過(guò)程中必須添加優(yōu)質(zhì)蛋白和賴氨酸等飼料添加劑才能滿足畜禽生長(zhǎng)發(fā)育的需要[3]。在四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)中發(fā)現(xiàn)的高賴氨酸蛋白基因,已成功地在多種轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)并提高了賴氨酸含量[4-6],而高賴氨酸蛋白基因是否可以在微生物中表達(dá),進(jìn)而提高賴氨酸含量,尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)前期工作發(fā)現(xiàn)益生菌可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能,可能與其賴氨酸含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究高賴氨酸蛋白基因在大腸埃希菌中的表達(dá),為益生菌中表達(dá)該基因,進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化率提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 四棱豆購(gòu)于河南順強(qiáng)農(nóng)科院;E.coliRosetta由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)徐世文教授惠贈(zèng);質(zhì)粒載體pGEX-4T-1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高繼國(guó)教授惠贈(zèng)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Trizol購(gòu)自invitrogen公司;PrimeScript RT-PCR Kit、TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自大連寶生物科技有限公司;氨芐青霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海生工生物工程公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司;引物由大連寶生物工程公司合成;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 四棱豆總RNA的提取 采用Trizol法提取總RNA,cDNA的合成采用試劑盒方法(見(jiàn)寶生物PrimeScript RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū))。

1.2.2 wblys的PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[7]與Uninted States Patent(登錄號(hào)：US 6,184,437 B1)報(bào)道的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物。5′端分別引入B amH I酶切位點(diǎn)和SalI酶切位點(diǎn)(下劃線表示),用于wblys基因PCR擴(kuò)增的引物：上游：5′-CG GGATCC CATTATGGGTGTTTTCACATATGAG-3′;下游：5′-GC GTCGACATTGTATTCAGGATGGGCCAAAAGG-3′。以四棱豆的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,條件如下：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s,56℃退火60 s,72℃延伸80 s,36個(gè)循環(huán);4℃保溫。取5μL PCR產(chǎn)物用于1%的瓊脂糖凝膠電泳。按Axygen凝膠回收試劑盒說(shuō)明,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建和目的基因測(cè)序 分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增的高賴氨酸蛋白基因片段和質(zhì)粒pGEX-4T-1,利用T4 DNA連接酶與高賴氨酸蛋白基因片段連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/wblys,將pGEX-4T-1/wblys轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta,涂布于含有Ampicillin 100μg/mL的LB固體培養(yǎng)基,采用菌落PCR鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,送大連寶生物工程公司進(jìn)行目的基因測(cè)序。

1.2.4 wblys的誘導(dǎo)和表達(dá) 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子從固體培養(yǎng)基接入含Ampicillin 100μg/mL的20 mL LB液體培養(yǎng)基中,于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,以1%的接種量轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基,繼續(xù)于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6左右,在37℃下采用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h。

1.2.5 SDS-PAGE分析 取誘導(dǎo)后的菌體培養(yǎng)液離心收集菌體,重懸于100μL 2×樣品緩沖液中,100℃煮沸,進(jìn)行SDS-PAGE分析,具體方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.6 高效液相色譜檢測(cè)賴氨酸含量 測(cè)定菌株的總賴氨酸含量,取菌體沉淀和上清,按照GB/T 18246-2000[9]中酸水解法進(jìn)行水解。水解后,定容至25 mL。吸取1 mL濾液,分別置于25 mL具塞離心管中,再分別吸取pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3緩沖液2 mL,混勻后,加入CDNB溶液各1 mL,混勻,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后直接上樣,體積10μL,測(cè)定其中賴氨酸含量。具體方法參照文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 高賴氨酸蛋白基因(wblys)的擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增出約500 bp的DNA片段,與預(yù)期大小基本一致,見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果表明,該片段全長(zhǎng)495 bp,與US 6,184,437 B1報(bào)道序列的同源性達(dá)100%。

圖1 四棱豆wblys基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR products ofwblysgene of Psophocarpus tetragonolobus

2.2 表達(dá)載體pGEX-4T-1/wblys的構(gòu)建

宿主的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出一條約500 bp的條帶,條帶大小符合預(yù)測(cè)值,并對(duì)相應(yīng)的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果均完全符合要求,見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/wblys酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plas mid pGEX-4T-1/wblys

2.3 表達(dá)載體pGEX-4T-1/wblys在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的重組菌均有比較明顯的重組蛋白表達(dá)帶(圖3),重組蛋白的分子質(zhì)量約為44 ku,與預(yù)測(cè)的GST融合表達(dá)的44 ku的分子質(zhì)量基本一致。

圖3 大腸埃希菌蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis ofE.coliprotein induced by IPTG

2.4 細(xì)菌發(fā)酵液及菌體中賴氨酸含量檢測(cè)的結(jié)果

誘導(dǎo)前后發(fā)酵液中賴氨酸含量幾乎沒(méi)有變化,菌體賴氨酸含量檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出,誘導(dǎo)后pGEX-4T-1/wblys/Rosetta的賴氨酸含量明顯高于其他組,誘導(dǎo)后菌體總賴氨酸含量比正常菌體提高15.84 mg/g,誘導(dǎo)后pGEX-4T-1/Rosetta的賴氨酸含量顯著低于其他組,可能是由于GST標(biāo)簽的存在降低了賴氨酸的量。

表1 3種菌體中賴氨酸含量Table 1 The lysine produced in the fermentation broths of 3 kinds of strains

3 結(jié) 論

本研究所用的富含高賴氨酸的cDNA為四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus,又名翅豆,winged bean)富含高賴氨酸的編碼蛋白cDNA,從cDNA推論的氨基酸序列可知該蛋白質(zhì)的賴氨酸含量占10.8%,是這個(gè)蛋白質(zhì)中最豐富的氨基酸[7]。本研究采用轉(zhuǎn)基因的方法將其轉(zhuǎn)入大腸埃希菌中,從而使大腸埃希菌中賴氨酸含量提高15.84 mg/g,也是第一次將高賴氨酸蛋白基因由植物轉(zhuǎn)入微生物中。在本研究中使用的是pGEX-4T-1載體,是原核表達(dá)的高效載體,但由于該載體存在GST標(biāo)簽可能使誘導(dǎo)后pGEX-4T-1/Rosetta的賴氨酸含量下降,具體的原因需要進(jìn)一步的研究,接下來(lái)的研究要實(shí)現(xiàn)更高效的表達(dá),本研究成功的為今后開(kāi)展該基因在益生菌中高效表達(dá)并應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)提供了重要工作基礎(chǔ)。

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