陳旭玉,甘炳春

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南萬寧 571533)

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi),并與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。內(nèi)生細(xì)菌常分泌一些活性物質(zhì)來促進(jìn)植物生長和抵制病蟲害[1]。細(xì)菌具有生長速度快,易成活等特點(diǎn),從植物中分離具有抗菌活性的內(nèi)生細(xì)菌用于防治植物病害是具有重要的意義。香蕉炭疽病是香蕉采后的一種重要病害,目前仍以化學(xué)殺菌劑為主,但長期使用化學(xué)殺菌劑不僅使香蕉炭疽菌產(chǎn)生抗藥性,而且農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染及威脅人類健康等,因此研究安全有效的防治措施勢在必行,其中生物防治是最有應(yīng)用前景的措施之一[2]。本文從藥用植物中分離到2株對香蕉炭疽病具有抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌并對其進(jìn)行鑒定,為以后的大田防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株 2008年8月至2008年10月從海南霸王嶺采集健康蛇足石杉植株,從中共分離出36株內(nèi)生細(xì)菌。香蕉炭疽菌(Colletordchum m uscae)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 將蛇足石杉沖洗干凈后,用75%的酒精浸泡1 min,用無菌水沖洗3次,接著用10%的次氯酸鈉浸泡5 min,無菌水沖洗3次,設(shè)立最后1次水作為對照,涂布于培養(yǎng)皿中,如無菌落產(chǎn)生,說明材料消毒徹底,否則不能保證是內(nèi)生細(xì)菌。將植株轉(zhuǎn)入無菌研缽中研磨勻漿,加5 mL水于研缽中靜置30 min,以此為母液,稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度懸液。取20μL于PDA平板中涂布,每個處理重復(fù)3次。最后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取不同的菌落。

1.2.2 室內(nèi)拮抗性測定 采用對峙培養(yǎng)法,首先在培養(yǎng)皿中央接種香蕉炭疽菌菌塊,直徑為5 mm,27℃恒溫培養(yǎng)24 h,然后在平板的4角分別接分離菌株,在平板的4角接滅菌的蒸餾水作為對照,27℃恒溫培養(yǎng)72 h,共同培養(yǎng)至出現(xiàn)抑菌圈。測量各分離菌菌落邊緣和香蕉炭疽菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度,選出拮抗作用明顯的細(xì)菌進(jìn)一步作拮抗菌株試驗(yàn)。

1.2.3 16S r DNA片斷擴(kuò)增和序列分析 ①16S rDNA片斷擴(kuò)增：以擴(kuò)增細(xì)菌DNA為模板,16S rDNA為引物。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′,反向引物：5′-TACCTTGTTACGACT T-3′。總體積25μL的反應(yīng)體系：模板(細(xì)菌DNA)0.5～1μL,正向引物(10 mol/L)1μL,反向引物(10 mol/L)1μL,2×MasteerMix 12.5μL,ddH2O 10μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min;變性94℃30 s,50℃30 s,72℃10 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min;②DNA序列測定及分析：PCR產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道的序列進(jìn)行同源性比較。并采用軟件MEGA 4.0的鄰近相連法(Neigh-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌PCR擴(kuò)增

經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測,基因組DNA擴(kuò)增得到的16S rDNA核苷酸片段與DL2000Mark比較,約在1 500 bp處出現(xiàn)特異性條帶,其分子量大小與16S rDNA編碼區(qū)域的片段長度相吻合(見圖1、圖2)。

2.2 測序及序列分析

為了進(jìn)一步確定菌株的分類學(xué)地位,測定其16S rDNA的基因序列,測出的序列分別為1 081 bp和398 bp。JXS1-6和AHL1-1序列與NCB I(http：//www.ncbi.n lm.nih.gov)上相似序列比對結(jié)果表明：JXS1-6與B urkholderiacepacia(AM711586)的序列相似性為95%,AHL1-1與B urkholderia cepacia(GU998815)的序列相似性為99%。菌株JXS1-6、AHL1-1與GenBank中相似性較高的10株菌株采用MEGA 4.0軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。分析顯示：拮抗菌JXS1-6、AHL1-1和B urkholderia cepacia的6株代表菌株聚在一支并且支持率為100%。通過序列系統(tǒng)發(fā)育分析初步判斷拮抗菌JXS1-6和AHL1-1屬于伯克氏菌屬(B urkholderia),伯克氏菌科(Burkholderiaceae),伯克氏菌目(Burkholderiales),β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。

圖3 拮抗細(xì)菌JXS1-6和AHL1-1序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree generated by the neighbor-joiningmethod based on the DNA sequences

2.3 JXS1-6和AHY1-1對香蕉炭疽病的抑制作用

JXS1-6和AHL1-1對香蕉炭疽病有抑制作用,前者的抑制作用更加明顯。由圖4看出,JXS1-6和AHL1-1菌株在培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生明顯的抑菌帶,帶寬分別為9 mm、4 mm,這說明JXS1-6和AHL1-1菌株的某些分泌物可抑制香蕉炭疽病病原菌的生長。

圖4 2株拮抗細(xì)菌對香蕉炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibition effect of two strain JXS1-6 and AHL1-1 onColletotrichum musae

3 討 論

香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)是一種引起香蕉采后病害的最重要病原,目前主要是用生防菌(如枯草芽胞桿菌[3-4]、鏈霉菌[5]、假單胞桿菌等[6])和海藻蛋白[7]、荔枝草[8]、艾蒿[9]等植物活性物質(zhì)對香蕉炭疽病進(jìn)行生物防治。從藥用植物蛇足石杉中分離內(nèi)生細(xì)菌伯克霍爾德屬(B urkholderia)防治香蕉炭疽病是第一次報道。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析在細(xì)菌鑒定中越來越得到廣泛的應(yīng)用。雖然傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)比較完善,但是由于鑒定步驟繁多、耗時長和主觀判斷的干擾給鑒定工作帶來誤差[10]。本文從珍貴藥用植物蛇足石杉中分離到2株具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌,并通過ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分類地位的劃分,這2株對香蕉炭疽病具有拮抗作用的內(nèi)生真菌均鑒定為伯克氏菌屬(Burkholderia)。

伯克氏菌屬是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭陰性細(xì)菌,并且具有多種特有的功效,能分解土壤中殘留的農(nóng)藥、凈化污水,降解油脂等。如秦華明等[11]從長期受油污染的土壤中分離篩選得到的Burkholderia cepaciaX4菌株能高效降解油脂。B urkholderia還能促進(jìn)植物的生長,常作為生防菌,如楊森等[12]從土壤中分離1株B urkholderia對小麥赤霉、煙草赤霉、馬鈴薯干腐、西瓜枯萎,及棉花、番茄、酥梨病害的霉菌有明顯的抑制作用。Jin Hong[13]也從土壤中分離1株對植物真菌病害有作用的Burkholderia菌株。牟志美等[14]從健康桑葉片中分離到B urkholderia并在桑樹體內(nèi)定殖,發(fā)現(xiàn)在定植的過程中菌株的拮抗性能未改變。

本實(shí)驗(yàn)從藥用植物篩選出的菌株JXS1-6和AHL1-1對香蕉炭疽病有很強(qiáng)的抑制作用,但其拮抗機(jī)制及產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)及其在香蕉中的定殖能力如何等尚有待于進(jìn)一步研究。

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