劉虎虎,田 云,盧向陽(yáng),方 俊

(1.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所,湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生

微生物世界是分子多樣性最大的天然資源庫(kù),由于地球上絕大部分微生物(約99%)是未培養(yǎng)微生物,即指那些利用分子生物學(xué)技術(shù)能夠檢測(cè)到,迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離、培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。因此,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法極大地限制了人們認(rèn)識(shí)微生物世界的視野。由于未培養(yǎng)微生物在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例,無(wú)論是其物種類群,還是新陳代謝途徑、生理生化反應(yīng)、產(chǎn)物等都存在著不同程度的差異性和豐富的多樣性,因而其中勢(shì)必蘊(yùn)涵著巨大的可開發(fā)生物資源。因此,如何有效開發(fā)利用這些微生物資源已受到廣大科研人員的高度重視。隨著生命科學(xué)與生物技術(shù)的飛速發(fā)展,多種分子生物學(xué)技術(shù)先后應(yīng)用于微生物,特別是未培養(yǎng)微生物的研究,如利用16S rRNA分析復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中未知微生物的種類。1994年,澳大利亞科學(xué)家W ilkins和W illiams[1]提出蛋白質(zhì)組的概念,指一個(gè)基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì),或細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時(shí)空所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的生理結(jié)構(gòu)與代謝過程的科學(xué),但是對(duì)于組成復(fù)雜的天然樣品或含有大量不可培養(yǎng)微生物的自然微生物區(qū)系,蛋白質(zhì)組學(xué)研究還很不足。1998年,Handels man等[2]首次正式提出宏基因組的概念,最初用來定義土壤細(xì)菌混合基因組,研究對(duì)象是生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和(the genomes of the total microbiota found in nature),主要包括環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌?，F(xiàn)在宏基因組是指特定環(huán)境中所有生物遺傳物質(zhì)的總和,以生態(tài)環(huán)境中全部DNA作為研究對(duì)象[3],避開了微生物分離培養(yǎng)的問題,極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間。目前宏基因組主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和,也可指特定環(huán)境或共生體內(nèi)所有生物遺傳物質(zhì)的總和,是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)[3]。而宏基因組學(xué)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象,以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段,以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。宏基因組學(xué)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了對(duì)復(fù)雜微生物多樣性及其遺傳物質(zhì)的研究,它在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)研究方法所存在的局限性。宏基因組學(xué)的出現(xiàn)標(biāo)志著基因組學(xué)分析從單一微生物擴(kuò)展到復(fù)雜的微生物區(qū)系,但是它不能從基因水平上很好地解釋系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)性。2004年,Rodriguez-Valera[4]在宏基因組和蛋白質(zhì)組基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步提出了宏蛋白質(zhì)組的概念,它是指環(huán)境混合微生物群落中所有生物的蛋白質(zhì)組總和。宏蛋白質(zhì)組學(xué)則是針對(duì)某一特定地點(diǎn)的微生物群落所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)而進(jìn)行大規(guī)模研究的方法[5]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)與宏基因組學(xué)在生物基因表達(dá)與功能水平上是相對(duì)應(yīng)的,兩者都是針對(duì)微生物特定時(shí)期動(dòng)態(tài)的生命活動(dòng)而進(jìn)行的研究。兩者對(duì)應(yīng)關(guān)系[6]如圖1所示。

圖1 微生物群落基因功能表達(dá)與研究示意圖Fig.1 Schematic expression and research of gene in the ecology ofmicrobial communities

2 宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略及應(yīng)用

2.1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)路線及其策略

用于研究微生物群落的宏蛋白質(zhì)組學(xué)與普通蛋白質(zhì)組學(xué)在思路上基本相同。根據(jù)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的差異與不同的技術(shù)手段設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)路線。首先,對(duì)環(huán)境混合微生物群落中所有生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取與純化。宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象是特定環(huán)境中微生物所產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì),因此,蛋白質(zhì)的提取與純化是宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵,但目前尚未存在一種通用的方法用于對(duì)全部蛋白質(zhì)的提取。2009年,Abram等[7]采用聲波降解法與弗氏壓碎器破碎法提取總蛋白質(zhì),并應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組技術(shù)研究在污水處理過程中微生物厭氧消化時(shí)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)聲波降解法所提取的蛋白質(zhì)能夠增加雙向電泳分離蛋白質(zhì)效果;其次,對(duì)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。目前蛋白質(zhì)的分離一般采用雙向電泳與色譜技術(shù);最后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定與分析。對(duì)于蛋白質(zhì)的鑒定主要依賴于質(zhì)譜技術(shù)。比較常用的質(zhì)譜技術(shù)包括基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALD I-TOF-MS)、電噴霧質(zhì)譜(Electrospray ionisation mass spectrometry,ESI-MS)與四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Quadrupole t ime-of-flight mass spectrometry,Q-TOF-MS)等。將經(jīng)過質(zhì)譜技術(shù)所鑒定的蛋白質(zhì)序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索即可獲得目的蛋白的相關(guān)信息,但目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)大多來源于已培養(yǎng)微生物,數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的未培養(yǎng)微生物蛋白質(zhì)的信息非常少,這是現(xiàn)在宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨的一個(gè)重大問題[8]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)路線如圖2所示[9]。W i lmes提到宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要有兩個(gè)策略：一個(gè)是基于雙向電泳技術(shù)分析鑒定微生物蛋白質(zhì)表達(dá);另一個(gè)則是基于液相色譜技術(shù)分析鑒定微生物蛋白質(zhì)表達(dá)[10]。

圖2 宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù)路線示意圖Fig.2 Schematic approach of metaproteomics technique

2.2 宏蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

2.2.1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在活性污泥微生物研究中的應(yīng)用 Wilmes等[11]運(yùn)用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究活性污泥系統(tǒng)在強(qiáng)化生物除磷(Enhanced biological phosphorus removal,EBPR)過程中微生物蛋白質(zhì)的表達(dá)情況?；钚晕勰嘣趨捬醐h(huán)境與好氧環(huán)境交替進(jìn)行過程中可以增強(qiáng)生物除磷,在該過程中活性污泥微生物的蛋白質(zhì)發(fā)揮著重要作用。經(jīng)雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)鑒定出3個(gè)差異蛋白質(zhì),進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)分析推測(cè)這些蛋白質(zhì)可能由β-變形細(xì)菌合成。W ilmes等[12]進(jìn)一步運(yùn)用雙向電泳與熒光原位雜交技術(shù)研究不同處理方法對(duì)活性污泥微生物總蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,經(jīng)反應(yīng)器處理的活性污泥定義為“EBPR”樣品,未經(jīng)反應(yīng)器處理的活性污泥定義為“nEBPR”樣品,反應(yīng)器可使活性污泥中微生物在厭氧環(huán)境與好氧環(huán)境不同兩相中交替進(jìn)行生物除磷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)反應(yīng)器處理的“EBPR”樣品分離得到630個(gè)蛋白質(zhì),反應(yīng)前后存在表達(dá)差異的蛋白質(zhì)占9.4%;而未經(jīng)反應(yīng)器處理的“nEBPR”樣品分離得到590個(gè)蛋白質(zhì),存在表達(dá)差異的蛋白質(zhì)占14.7%。在此基礎(chǔ)之上,W ilmes等[13]運(yùn)用雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)鑒定活性污泥中微生物在生物除磷過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì),共鑒定出與生物除磷過程相關(guān)的蛋白質(zhì)46個(gè),這些蛋白質(zhì)可能分別參與糖原的合成與分解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸的合成等生化反應(yīng)。Park等[14]利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)研究活性污泥蛋白質(zhì)在厭氧與好氧等不同環(huán)境中的表達(dá)情況,并運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-mass spectrography,LC-MS/MS)對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定與分析,發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)差異蛋白質(zhì)為巴氏甲烷八疊球菌甲基化輔酶M還原酶(Methyl-coenzyme M reductase,MCMR)的亞基。

2.2.2 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在微生物起源研究中的應(yīng)用 Kan等[15]利用雙向電泳和LC-MS/MS對(duì)切薩皮克海灣不同水域中微生物群落進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該海灣不同水域所分離的微生物蛋白質(zhì)的表達(dá)存在差異,經(jīng)質(zhì)譜鑒定表明這些差異蛋白質(zhì)與已知數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)不匹配,經(jīng)進(jìn)一步鑒定與生物信息學(xué)分析,其中3個(gè)蛋白質(zhì)(CB1、CB3、CB6)可能與海洋微生物起源有關(guān),其中CB3可能是NADH-輔酶Q氧化還原酶的亞基,而CB6與氨肽酶功能相類似。

2.2.3 宏蛋白質(zhì)學(xué)在微生物脅迫應(yīng)答中的應(yīng)用Lacerda等[16]運(yùn)用雙向電泳、MALD I-TOF-MS與肽端從頭測(cè)序技術(shù)研究重金屬鎘對(duì)細(xì)菌生物群落蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重金屬鎘處理0.25 h與3 h時(shí)微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化,一共鑒定出109個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)包括ATP酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等,這是首次應(yīng)用從頭測(cè)序技術(shù)在大規(guī)模范圍內(nèi)研究未知微生物蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。

2.2.4 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在腸道微生物研究中的應(yīng)用 Klaassene等[17]利用雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)分析了一個(gè)家庭中嬰兒A和嬰兒B在斷奶之前不同時(shí)間排泄物中未培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)情況,研究發(fā)現(xiàn)排泄物在不同時(shí)期所含微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)存在著一定的差異。研究以嬰兒A 41 d排泄物為樣品,應(yīng)用MALD I-TOF-MS鑒定55個(gè)蛋白點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)其與數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配。對(duì)于嬰兒A不同時(shí)期(8、24、41 d)相同的4個(gè)蛋白質(zhì)位點(diǎn)(1、2、7、11)進(jìn)行鑒定分析發(fā)現(xiàn)其與已報(bào)道蛋白質(zhì)存在差異。與此同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)含有肽端序列的蛋白質(zhì)與雙歧桿菌的轉(zhuǎn)移酶相類似。Verberkmoes等[18]利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究幼兒雙胞胎各自排泄物中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,并以此推測(cè)人體腸道微生物的代謝情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)宏蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)于宏基因組學(xué)呈非正態(tài)分布。此外,研究發(fā)現(xiàn)樣品中部分蛋白質(zhì)屬于同源蛋白,它們可能參與人體免疫和微生物代謝活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)之所以選擇人體排泄物作為樣品,是因?yàn)榕判刮锞哂蟹乔秩胄?而且樣品中部分蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定分析與人體內(nèi)蛋白質(zhì)相同,這些蛋白質(zhì)具有一定的代表性。

2.2.5 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在口腔微生物研究中的應(yīng)用 J.D.Rudney等[19]應(yīng)用三維肽段分離技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)分別取自口腔癌患者與正常人群唾液樣品微生物進(jìn)行宏蛋白質(zhì)組分析。實(shí)驗(yàn)主要以口腔癌患者唾液為研究對(duì)象,并根據(jù)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)差異分離鑒定出7 000個(gè)多肽,其中357個(gè)多肽與微生物起源相關(guān)。研究通過系統(tǒng)進(jìn)化方法分析這些多肽發(fā)現(xiàn)其主要屬細(xì)菌類群。在種分類學(xué)劃分水平,僅鑒定出11%多肽;在門分類學(xué)劃分水平,29%多肽屬厚壁門,其中大部分多肽屬鏈球菌屬;20%多肽屬變形菌門;4%多肽屬放線菌門;3%多肽屬擬桿菌門;1%多肽屬螺旋體門等。研究經(jīng)通路分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)同源蛋白質(zhì)簇(Clusters of Orthologous Groups,COGs)中37%多肽屬J組,參與蛋白翻譯;19%多肽屬G組,參與糖酵解過程;8.2%多肽屬E組,參與氨基酸代謝;7.9%多肽屬C組,與產(chǎn)能有關(guān)。此外,研究還發(fā)現(xiàn)包括蚜蟲內(nèi)生共生體、極端微生物與古細(xì)菌在內(nèi)的部分新物種。

2.2.6 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在膜蛋白研究中的應(yīng)用RobertM Morris等[20]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)南大西洋10個(gè)不同區(qū)域樣品表層水膜蛋白進(jìn)行研究分析。通過構(gòu)建16S rRNA文庫(kù)并對(duì)849個(gè)16S rRNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其中184個(gè)序列屬放線菌;31個(gè)序列屬細(xì)菌浮游生物;90個(gè)序列屬綠球藻;177個(gè)序列屬SAR11。它們的分布情況反映出不同海域富含不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作者對(duì)來自10個(gè)樣品共5 389個(gè)肽段進(jìn)行鑒定并對(duì)939個(gè)特殊肽段作進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)這些肽段大多屬TBDTs(TonB-dependent transporters)、孔蛋白與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些蛋白質(zhì)主要參與物質(zhì)運(yùn)輸過程,其中TBDTs通過質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究采用量多元尺度法與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)不同蛋白在沿海水域與公海水域含量存在差異。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)不同水域樣品中均含有視紫紅質(zhì)并推測(cè)光營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌浮游生物可以利用光能參與不同形式的生命活動(dòng)。此外,在南大西洋上層流發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌氨單加氧酶與病毒蛋白,據(jù)此推測(cè)古細(xì)菌作為一類重要的硝化細(xì)菌在富含營(yíng)養(yǎng)的表層水中起著重要的作用。

3 存在問題與展望

宏基因組學(xué)為微生物資源的開發(fā)利用提供了重要的信息,同時(shí)也為未培養(yǎng)微生物的研究提供了新的技術(shù)手段,但目前尚無(wú)較好方法用于研究微生物與環(huán)境之間的相互作用。宏蛋白質(zhì)組學(xué)概念的提出為解決這一難題提供了可能,它以微生物群落所產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定分析并研究微生物在復(fù)雜環(huán)境中生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化。宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究工作目前尚處于初級(jí)階段,仍存在許多問題有待解決。一方面來自微生物內(nèi)因,地球上約99%微生物屬未培養(yǎng)微生物,而且?guī)缀跛械奈⑸镌谄渖芷谥卸紩?huì)遇到各種不同的環(huán)境。這些微生物需要適當(dāng)調(diào)整其所表達(dá)的蛋白質(zhì),從而維護(hù)細(xì)胞內(nèi)部的代謝平衡。大多數(shù)微生物在不同的生長(zhǎng)環(huán)境下僅表達(dá)它們整個(gè)蛋白質(zhì)組中的一部分,較難獲得環(huán)境樣品中微生物所表達(dá)的高宏蛋白質(zhì)組覆蓋率;另一方面來自研究技術(shù)的局限性。比如雙向凝膠電泳技術(shù)不能夠檢測(cè)低豐度蛋白或具有極端物理化學(xué)屬性的蛋白,值得一提的是多維蛋白鑒定技術(shù)與GeLC-MS/MS方法在上述方面已取得一些進(jìn)步。此外,用來將肽段與特異性蛋白進(jìn)行匹配的生物信息學(xué)方法可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性鑒定結(jié)果,從而影響對(duì)于蛋白質(zhì)的分析鑒定。因此,解決這些問題成為推動(dòng)宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)主要力量。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,宏蛋白質(zhì)組學(xué)將在微生物群落研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

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