施先鋒，彭金光，李煜華，曾紅霞，杜念華，汪李平

(1.湖北省武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430051;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

三倍體西瓜兼具多倍體優(yōu)勢(shì)和雜交優(yōu)勢(shì)，由于無(wú)種子，能使更多的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為糖，具有品質(zhì)更好、食用方便、耐貯運(yùn)等諸多優(yōu)良品質(zhì)特點(diǎn)，而且也有較強(qiáng)的抗病性和抗逆性，因此倍受消費(fèi)者歡迎。而三倍體西瓜種子是通過(guò)以四倍體為母本，二倍體為父本進(jìn)行雜交獲得的，因此誘導(dǎo)西瓜四倍體的研究顯得尤為重要。而在四倍體育種中，通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)獲得的植株往往出現(xiàn)不同倍性的嵌合體、甚至八倍體，因此，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。雖然有關(guān)倍性鑒定已有較多報(bào)道［1-2］，但有關(guān)西瓜染色體倍性鑒定方法系統(tǒng)的研究甚少。本研究試圖通過(guò)研究、比較各種倍性鑒定方法，建立一套簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的西瓜倍性鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試3個(gè)西瓜品種均來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜實(shí)驗(yàn)室的二倍體及秋水仙素誘導(dǎo)獲得的同源四倍體，編號(hào)為 TS、MY和0517。栽植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心的試驗(yàn)大棚中，采用立體栽培方式，單蔓整枝，田間管理同一般大棚。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定法

根據(jù)植物多倍體形態(tài)特征［3］，結(jié)合田間生長(zhǎng)情況，觀察植株的葉片、花瓣大小及果皮厚度等特征進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 流式細(xì)胞儀鑒定法

采用德國(guó)Partec公司的PA流式細(xì)胞儀(Ploidy Analyser-I，Partec)檢測(cè)倍性。在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。該倍性分析儀帶PC和自動(dòng)分析及倍性判別軟件。試驗(yàn)方法參考張俊娥等［4］。

1.2.3 根尖染色體計(jì)數(shù)法

染色體制片方法采用去壁低滲法［5］，在Olympus BH-2型顯微鏡觀察和照相記錄。1.2.4 葉綠體計(jì)數(shù)法

待植株長(zhǎng)至坐果期時(shí)，9:00時(shí)，田間取幼嫩葉片，撕取葉片下表皮，置于載玻片上，滴1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，在AH3-RFCA型Olympus萬(wàn)能熒光顯微鏡下觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞。在分辨率為2 040×1 536的條件下照相并計(jì)算葉綠體數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS15.0做配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

四倍體植株伸蔓期比二倍體生長(zhǎng)要緩慢些，但幼苗出現(xiàn)分枝后，快速生長(zhǎng)。

由圖1可見(jiàn)四倍體的葉片比二倍體的葉片大而且厚，顏色也較深;雄花花瓣大且厚，顏色更為鮮艷，花柄更長(zhǎng)和粗;四倍體的果皮比二倍體的厚，種子少且厚。

2.2 DNA流式細(xì)胞儀倍性鑒定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，二倍體植株主峰熒光強(qiáng)度位于50 AU(圖2中A)，而四倍體主峰熒光強(qiáng)度位于約100 AU(圖2中B)，說(shuō)明四倍體植株細(xì)胞DNA含量為二倍體的2倍。

2.3 染色體數(shù)目鑒定

染色體壓片觀察二倍體的根尖染色體數(shù)均為2n=2x=22(圖3中 a)，四倍體的染色體數(shù)目則為2n=4x=44(圖3中b)，是二倍體的2倍。

圖1 二倍體與四倍體的形態(tài)學(xué)比較

圖2 植株葉片中DNA含量分布曲線

圖3 二倍體 (a)與四倍體 (b)的染色體

2.4 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體計(jì)數(shù)法

由表1可見(jiàn)，相對(duì)二倍體的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)而言，對(duì)應(yīng)同源四倍體的葉綠體數(shù)均有所增加。配對(duì)樣本 t檢驗(yàn)結(jié)果表明，t=-13.22，t檢驗(yàn)的雙尾顯著性概率0.006＜0.01，表明二倍體和四倍體間的葉綠體數(shù)差異達(dá)極顯著水平。經(jīng)單因素方差分析，二倍體不同品種間的F分布的顯著性概率0.68＞0.05，四倍體的概率0.27＞0.05，說(shuō)明同一倍性不同品種間葉綠體數(shù)差異不顯著。

綜上所述，不同倍性間差異極顯著，而同一倍性不同品種間葉綠體數(shù)差異不顯著。因此，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目可作為染色體倍性的鑒定依據(jù)之一。從圖4可清晰區(qū)分不同倍性西瓜氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的差異。

表1 二倍體和四倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)比較

圖4 西瓜不同倍性氣孔保衛(wèi)細(xì)胞及其葉綠體數(shù)

3 小結(jié)與討論

在誘導(dǎo)西瓜多倍體過(guò)程中，準(zhǔn)確及時(shí)鑒定出四倍體不僅可縮短育種周期，還能提高四倍體育種工作效率。郭啟高等［6］在離體培養(yǎng)過(guò)程中利用不定芽葉尖染色體計(jì)數(shù)，在組織培養(yǎng)早期100%檢出倍性。利用流式細(xì)胞儀可快速檢測(cè)出西瓜再生芽倍性［7］。譚素英［8］研究認(rèn)為在西瓜上葉片保衛(wèi)細(xì)胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。二倍體和四倍體西瓜植株在形態(tài)上有比較明顯的差別。Compton等［9］研究發(fā)現(xiàn)子房直徑、雄花的花瓣和花粉囊直徑、葉長(zhǎng)與葉寬比是西瓜倍性水平很好的標(biāo)志。本試驗(yàn)結(jié)果表明:染色體計(jì)數(shù)法作為直接的倍性鑒定方法，精確、可靠，但費(fèi)時(shí)且需要熟練的細(xì)胞學(xué)操作技術(shù);流式細(xì)胞儀可用于西瓜的早期倍性鑒定;保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目與西瓜倍性密切相關(guān)，是有效的間接方法;二倍體和四倍體植株在長(zhǎng)勢(shì)、花冠形態(tài)、果皮厚度及種子數(shù)量和厚度等方面有明顯差異，也能初步確定西瓜倍性，但要在較晚時(shí)期鑒定，難以及時(shí)采取加倍等措施，使育種材料不能得到充分利用。

［1］ 劉文革，閻志紅，饒小莉.不同倍性西瓜的葉表皮微形態(tài)特征比較 ［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005(1):31-34.

［2］ Compton M E，Barnett N ，Gray D J.Use of fluorescein diacetate(FDA)to determine ploidy of in vitro watermelon shoots ［J］.Plant Cell Tissue Org Cult，1999，58:199-203.

［3］ 王志敏，牛義，宋明，等.多倍體誘導(dǎo)在蔬菜育種上的應(yīng)用［J］.生物學(xué)雜志，2004，21(6):35-38.

［4］ 張俊娥，劉繼紅，鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異 ［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(2):169-174.

［5］ 馬雙武，劉君璞，王吉明，等.西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn) ［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.

［6］ 郭啟高，宋明，楊天秀，等.西瓜試管苗中四倍體鑒定方法研究 ［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(3):298-300.

［7］ Zhang X P，Rhodes B B，Whitesides J F.Shoot regeneration from immature cotyledons of watermelon ［J］. Cucurbit GenetCoop Rep，1994，17:102-105.

［8］ 譚素英.西瓜不同倍體葉保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)觀察 ［J］.果樹(shù)科學(xué)，1985，2(1):34-36.

［9］ Compton，M E，Gray D J ，Elmstrom G W.Identification of tetraploid regenerants from cotyledons of diploid watermelon cultured in vitro ［J］.Euphytica，1996，87:165-172.