白雪梅,趙愛(ài)蘭,張少敏,王憶婷,孫 暉,葉長(zhǎng)蕓

豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與Tn916接合型轉(zhuǎn)座子的關(guān)系＊

白雪梅,趙愛(ài)蘭,張少敏,王憶婷,孫 暉,葉長(zhǎng)蕓

目的 研究我國(guó)分離的血清2型豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與 Tn916接合型轉(zhuǎn)座子的關(guān)系。方法采用微量稀釋法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè),PCR方法檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因及Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。結(jié)果我們檢測(cè)了56株我國(guó)分離的血清2型豬鏈球菌及12株國(guó)外分離的血清2型豬鏈球菌,56株我國(guó)分離株均對(duì)四環(huán)素耐藥并且攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(M),我國(guó)豬鏈球菌攜帶的tet(M)基因位于接合型轉(zhuǎn)座子 Tn916上。12株國(guó)外分離株有7株對(duì)四環(huán)素耐藥,這7株菌攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(O)并且 Tn916檢測(cè)為陰性。結(jié)論Tn916上的tet(M)基因編碼了我國(guó)血清2型豬鏈球菌的四環(huán)素耐藥性,我國(guó)血清2型豬鏈球菌可能在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式獲得了Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。

豬鏈球菌;tet(M)耐藥基因;接合型轉(zhuǎn)座子

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病原菌,2005年我國(guó)四川省暴發(fā)了豬鏈球菌引起人類感染的疫情,204人感染,38人死亡。在世界范圍內(nèi),截至2007年共有409人感染豬鏈球菌的報(bào)道,共73人死亡〔1〕。這一人獸共患病原菌越來(lái)越受到關(guān)注。我們以前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離株具有比較普遍的四環(huán)素耐藥性。有研究表明,轉(zhuǎn)座子Tn916介導(dǎo)了四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移。為此,我們通過(guò)進(jìn)一步的檢測(cè)探討了豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與轉(zhuǎn)座子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 我國(guó)分離的56株豬鏈球菌包括:1998年江蘇病人來(lái)源菌株3株,豬來(lái)源菌株2株,2005年四川病人來(lái)源菌株30株,四川豬來(lái)源菌株5株,廣東病人來(lái)源菌株1株,廣西病人來(lái)源菌株1株,貴州病人來(lái)源菌株1株,江西病人來(lái)源菌株1株,江西豬來(lái)源菌株1株。2006年四川健康豬來(lái)源菌株5株,2007年四川健康豬來(lái)源菌株5株。2009年病人來(lái)源菌株1株。12株國(guó)外來(lái)源菌株為加拿大Gao ttschalk教授惠贈(zèng)。

1.2 藥敏實(shí)驗(yàn)方法 采用DADE BEHRING公司生產(chǎn)的1型 M ICroSTREP PLusTM鏈球菌藥物敏感性檢測(cè)板。同時(shí)接種質(zhì)控菌株A TCC49619進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的質(zhì)量控制。

1.3 耐藥基因檢測(cè) 目前發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素耐藥基因已達(dá)30多種,我們檢測(cè)了革蘭氏陽(yáng)性菌常見(jiàn)的5種四環(huán)素耐藥基因 tet(K)、tet(L)、tet(M)、tet(O)和tet(Q)〔2〕。

1.4 接合型轉(zhuǎn)座子 Tn916的檢測(cè) Tn916是于1981年在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)接合型轉(zhuǎn)座子。糞腸球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)長(zhǎng)度為18kb,攜帶有四環(huán)素耐藥基因tet(M),共24個(gè)ORF(見(jiàn)圖1和表1)。使用PCR方法,在實(shí)驗(yàn)菌株中對(duì)Tn916轉(zhuǎn)座子編碼的24個(gè)ORF進(jìn)行了檢測(cè)。

圖1 轉(zhuǎn)座子Tn916結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Genetic organization of transposon Tn916

表1 轉(zhuǎn)座子Tn916的檢測(cè)引物Table 1 Primers for detection of transposon Tn916

1.5 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行直接測(cè)序,由TA KARA公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果 我國(guó)分離的56株豬鏈球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、美羅培南、左旋氟沙星、氯霉素、紅霉素、阿齊霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素均敏感,對(duì)四環(huán)素均耐藥。加拿大惠贈(zèng)的12株血清2型豬鏈球菌中,有7株菌對(duì)四環(huán)素耐藥。

2.2 四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 使用PCR方法檢測(cè)了四環(huán)素相關(guān)的耐藥基因5種,發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離的56株菌均攜帶tet(M)基因。加拿大惠贈(zèng)的12株血清2型豬鏈球菌中,有7株菌對(duì)四環(huán)素耐藥,這7株菌則攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(O)。

2.3 Tn916的檢測(cè)結(jié)果 Int-Tn是轉(zhuǎn)座子 Tn916的整合酶基因,編碼轉(zhuǎn)座子整合到新位點(diǎn)所需的整合酶,測(cè)定 Int-Tn是目前檢測(cè) Tn916常見(jiàn)的方法〔3〕。以 Int-Tn為代表基因檢測(cè)了我國(guó)分離的56株豬鏈球菌,結(jié)果均為陽(yáng)性。檢測(cè)的12株加拿大惠贈(zèng)菌株,結(jié)果均為陰性。為進(jìn)一步確定我國(guó)菌株攜帶Tn916的完整性,使用PCR方法檢測(cè)了 Tn916轉(zhuǎn)座子編碼的24個(gè)ORF,發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離的56株菌均攜帶完整的Tn916轉(zhuǎn)座子。

圖2 Tn916轉(zhuǎn)座子基因的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The PCR production of Tn916 1:ORF24;2:ORF23;3:ORF22;4:ORF21;5:ORF20;6:ORF19;7:ORF18;8:ORF17;9:ORF16;10:ORF15;11:ORF14;12:ORF(13,12);13:tet(M);14:ORF(5,6,7,8,9,10);15:Xis-Tn;16:Int-Tn.

2.4 測(cè)序結(jié)果 以我國(guó)豬鏈球菌分離株SC84為代表,將 PCR產(chǎn)物測(cè)序后,得到了 SC84所攜帶轉(zhuǎn)座子的全序列。GenBank注冊(cè)號(hào)為 EF432727。將SC84菌株攜帶的 Tn916和已經(jīng)發(fā)表的糞腸球菌DS16攜帶的 Tn916序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)二者的同源性高達(dá)99.3%。在133個(gè)差異核苷酸中,有91個(gè)位于tet(M),他們的tet(M)序列的同源性為95%。除tet(M)外,其它區(qū)段只有42個(gè)堿基不同。

3 討 論

tet(M)是傳播最為廣泛的四環(huán)素耐藥基因,已從臨床分離的8種革蘭氏陰性菌,18種革蘭氏陽(yáng)性菌中檢出tet(M)基因〔4〕。加拿大惠贈(zèng)的12株血清2型豬鏈球菌,有7株對(duì)四環(huán)素耐藥,編碼基因?yàn)閠et(O)。tet(M)和 tet(O)均編碼核糖體保護(hù)蛋白,同源性可以達(dá)到75%,但tet(M)一般攜帶于接合型轉(zhuǎn)座子,而 tet(O)一般定位于染色體或質(zhì)?！?〕。tet(O)的傳播沒(méi)有tet(M)那樣廣泛。

tet(M)位于 Tn916家族接合型轉(zhuǎn)座子上。接合型轉(zhuǎn)座子能通過(guò)細(xì)胞間的接觸從供體菌基因組轉(zhuǎn)移到受體菌基因組。它兼具有轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和噬菌體的一些特征〔6〕。Tn916是于1981年在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的。后來(lái)又從其它細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)許多接合型轉(zhuǎn)座子 ,如 Tn916S、Tn5386、Tn6009 等〔7-9〕。糞腸球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)長(zhǎng)度為18kb,包括 tet(M)基因在內(nèi),共 24個(gè) ORF,ORF23～ORF13為接合性轉(zhuǎn)移基因,位于右末端。除ORF9外,所有基因方向?yàn)閺挠业阶?。Tn916整合酶基因(int)編碼重組酶,附近的切除酶基因(xis)編碼類似于lambda Xis的小基礎(chǔ)蛋白,目前尚有部分基因功能不明〔10〕。

我們?cè)谪i鏈球菌中檢測(cè)到了攜帶 tet(M)等位基因的 Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。與糞腸球菌DS16的Tn916(NC_006372)進(jìn)行全序列比較發(fā)現(xiàn),同源性達(dá)到99.3%。共有133個(gè)核苷酸的差異點(diǎn),其中91個(gè)位于 tet(M),他們的 tet(M)序列的同源性為95%。除tet(M)外的其它42個(gè)差異核苷酸,分布在15個(gè)基因上。每個(gè)基因分別有1～4個(gè)差異核苷酸。在加拿大惠贈(zèng)菌株中則沒(méi)有檢測(cè)出 Tn916的存在。Tn916家族接合型轉(zhuǎn)座子宿主譜廣泛,能在多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌間轉(zhuǎn)移,其中常見(jiàn)的是腸道正常菌群和條件致病菌即糞腸球菌。這提示我國(guó)分離豬鏈球菌攜帶的 tet(M)基因可能是由糞腸球菌水平轉(zhuǎn)移獲得的。另外,在我國(guó)分離的豬鏈球菌中檢測(cè)到了 Tn916轉(zhuǎn)座子的存在,這可能和四環(huán)素在養(yǎng)豬行業(yè)飼料添加劑中的廣泛使用有關(guān)。

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Relationship between tetracycline resistance of Streptococcus suis and Tn916-like con jugative transposon

BA IXue-mei,ZHAO Ai-lan,ZHANG Shao-min,WANG Yi-ting,SUN Hui,YE Chang-yun
(State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,National Institute for Communicable Diseases Control and Prevention,Chinese Center for Diseases Control and Prevention,Beijing 102206,China)

To study the relationship between tetracycline resistance of Streptococcussuis serotype 2 isolated in China and Tn916-like conjugative trans poson,microdilution method was employed for the analysis of antimicrobial sensitivity,and PCR detection of tetracycline resistance genes and Tn916 conjugative transposon was conducted.Tetracycline resistant gene detection was performed for the 56 serotype-2 strains of Streptococcus suis isolated in China and 12 from other countries.It was found that all 56 strains isolated in China was resistant to tetracycline and carried tet(M)gene,and those tet(M)genes carried by China’s Strep to coccus suis were all located on the conjugative transposon Tn916.While the 12 strains from other countries carried tet(O)gene instead of tet(O)gene.It is suggested that S.suisserotype 2 strain might have

the transposon Tn916 conjugative transposon by horizontal transferring during its evolution.

Streptococcus suis;tet(M)resistance gene;conjugative transposon

R378.1

A

1002-2694(2010)12-1085-03

＊科技部國(guó)際科技合作與交流專項(xiàng)(20072930)資助

葉長(zhǎng)蕓,Email:yechangyun@icdc.cn

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

2010-09-15;

2010-10-15