白 冰，余治健，徐廣健，王 進(jìn)，馬孝煜，張朝欽，鄭金鑫，鄧啟文，李多云

(1. 深圳大學(xué)南山醫(yī)院感染科及內(nèi)源性感染診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518052； 2. 長江水利委員會長江醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430019)

腸球菌已成為導(dǎo)致醫(yī)院感染的重要病原菌，其中又以糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，E.faecalis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium，E.faecium)最常見。第一代惡唑烷酮類抗生素利奈唑胺(linezolid， LZD)于2000年首先在美國被批準(zhǔn)用于臨床，對大多數(shù)革蘭陽性菌，特別是耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus, VRE)顯示出強(qiáng)大的抗菌活性，但應(yīng)用于臨床后不久就有耐利奈唑胺腸球菌的報道[1-2]。多重耐藥腸球菌對公眾衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，泰利唑胺(tedizolid，TZD)作為第二代惡唑烷酮類抗生素于2014年6月由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床,治療成人急性細(xì)菌性皮膚及軟組織感染[3-5]。然而，近年來也有對泰利唑胺不敏感腸球菌出現(xiàn)的相關(guān)報道[6]。本研究調(diào)查了2011—2016年某院住院患者糞腸球菌對泰利唑胺的敏感性。盡管該院從未使用過泰利唑胺，但仍發(fā)現(xiàn)了泰利唑胺不敏感的糞腸球菌。因此，本研究對泰利唑胺不敏感糞腸球菌的耐藥機(jī)制、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分布等做了進(jìn)一步的分析和探討。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2011年1月1日—2016年6月30日深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院臨床分離的糞腸球菌菌株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離株。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 參照第9版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，采用CATC腸球菌選擇培養(yǎng)基對試驗(yàn)菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用BD Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定，以及常用抗菌藥物(氨芐西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、利福平、四環(huán)素、呋喃西林、萬古霉素和利奈唑胺)的敏感性檢測。采用2016年版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[7]檢測試驗(yàn)菌株對泰利唑胺的最低抑菌濃度(MIC)，并再次確認(rèn)氨芐西林、萬古霉素和利奈唑胺的藥敏結(jié)果，以糞腸球菌ATCC 29212作為質(zhì)控菌株。泰利唑胺藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：敏感為MIC≤0.5 mg/L，不敏感為MIC>0.5 mg/L。

1.3 DNA提取和耐藥基因檢測 耐藥基因23S rRNA V區(qū)基因、耐藥基因cfr、cfr(B)及optrA引物由北京六合華大基因公司合成[8-11]。根據(jù)試劑盒說明書提取菌株基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測耐藥基因，PCR體系(50 μL)：Dream Taq Green PCR Master Mix(2×) 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL， 加 dd H2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min，PCR 產(chǎn)物于 4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無陽性擴(kuò)增產(chǎn)物及目的基因片段長度進(jìn)行判斷分析。

1.4 MLST 采用MLST分析腸球菌分離株的分子分型，參考糞腸球菌MLST 數(shù)據(jù)庫(http://efaecalis.mlst.net/)提供的分型方案，7個管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yqiL)[12-13]引物由北京六合華大基因公司合成。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，內(nèi)含2×ExTaq Mix 25 μL，10 μmol/L的正、反向引物各2.5 μL，模板DNA 2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃ 5 min變性，94℃ 30 s→52℃ 30 s→72℃ 60 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行雙向測序。序列分析用SeqMan(DNAStar Inc.，Madison，WI，USA)軟件對等位基因序列進(jìn)行拼接和校正，將整理好的序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫，確定每個管家基因的序列號。7個管家基因序列號的組合即為該菌株序列型別(ST)。對于未能完全匹配的序列和ST，重復(fù)3次確認(rèn)無誤后記為NT。應(yīng)用eBURST V3軟件確定分離菌株與數(shù)據(jù)庫其他菌株的關(guān)系，構(gòu)建克隆群時以2個等位基因的差異為定義克隆群的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌來源及患者分布 共收集糞腸球菌289株，來源科室主要為外科(57.4%)，其中泌尿外科檢出最多(64株)，其次為肝膽外科及重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)，均檢出31株。標(biāo)本來源主要為中段尿(126株，43.6%)，其次是傷口分泌物(60株，20.8%)、穿刺液(33株，11.4%)、血(30株，10.34%)、無菌體液(10株，3.5%)、呼吸道分泌物(9株，3.1%)、組織(6株，2.1%)、導(dǎo)管(2株，0.7%)。

2.2 糞腸球菌對泰利唑胺體外敏感性 檢出的糞腸球菌中大多對常用的多種抗菌藥物耐藥。其中對紅霉素、利福平和四環(huán)素耐藥最為突出，耐藥率均在50%以上。泰利唑胺對糞腸球菌的敏感率為94.1%。糞腸球菌對氨芐西林、呋喃西林和萬古霉素仍顯示出很高的敏感性(敏感率為97.9%～99.7%)。而且，幾乎所有的泰利唑胺非敏感糞腸球菌對氨芐西林、呋喃西林和萬古霉素都是敏感的。糞腸球菌對常用抗菌藥物的敏感性見表1。

表1 糞腸球菌對常用抗菌藥物的敏感性

TSEF：泰利唑胺敏感糞腸球菌；TNSEF：泰利唑胺不敏感糞腸球菌

2.3 糞腸球菌對泰利唑胺體外敏感性與其MLST之間的關(guān)系 采用MLST技術(shù)對289株糞腸球菌進(jìn)行同源性分析，共分為47個ST型(其中有48株的ST型與糞腸球菌MLST數(shù)據(jù)庫不匹配，標(biāo)記為NT)。優(yōu)勢ST分型為ST16和ST179，分別占29.1%(84株)和24.9%(72株)，見圖1。在泰利唑胺不敏感糞腸球菌中，ST16的比例高于ST179(P<0.05)，見圖2。

圖1 289株糞腸球菌MLST分布情況

2.4 糞腸球菌對泰利唑胺體外敏感性與其耐藥機(jī)制之間的關(guān)系 238株糞腸球菌中均未發(fā)現(xiàn)23S rRNA V區(qū)突變，也未檢出cfr和cfr(B)基因。共檢出11株攜帶optrA基因的糞腸球菌，其中9株對泰利唑胺不敏感。

TSEF：泰利唑胺敏感糞腸球菌；TNSEF：泰利唑胺不敏感糞腸球菌； *：差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖2泰利唑胺敏感及不敏感糞腸球菌菌株中ST16與ST179分型菌株占比的比較

Figure2Comparison of the proportion of ST16 and ST179 strains in TZD-susceptible and TZD-non-susceptibleE.faecalisstrains

3 討論

腸球菌是醫(yī)院感染的主要病原體之一，因其具有獲得編碼抗生素耐藥性基因的能力，且對多種抗菌藥物天然耐藥，給臨床治療造成許多困難。本研究中泰利唑胺對腸球菌MIC值與利奈唑胺相比更低，提示泰利唑胺具有更好的活性。與歐美國家的報道[14]不同，本研究中并未檢出耐萬古霉素糞腸球菌，而且?guī)缀跛屑S腸球菌對氨芐西林、呋喃妥因、萬古霉素、泰利唑胺均有良好的敏感性。值得一提的是，本研究中檢出的所有利奈唑胺或泰利唑胺不敏感的糞腸球菌菌株均對氨芐西林、萬古霉素和呋喃妥因敏感，因此，在對糞腸球菌感染的治療中這三種藥相較于更昂貴的利奈唑胺或泰利唑胺是更好的選擇。

既往研究[15]顯示，糞腸球菌中ST16在醫(yī)院感染中更為多見，而ST179在社區(qū)感染中較為多見。在本研究中，糞腸球菌的主要MLST為ST16和ST179，分型為ST16的糞腸球菌對泰利唑胺敏感率低于分型為ST179的菌株。提示社區(qū)感染的糞腸球菌比醫(yī)院感染的菌株具有更高的泰利唑胺敏感性，但仍需進(jìn)一步流行病學(xué)調(diào)查以證實(shí)。

有研究[16]提示23S rRNA V區(qū)突變可能是泰利唑胺耐藥的主要機(jī)制，特別是2576核苷酸從A到T的突變是臨床腸球菌中最常見的突變，但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)23S rRNA V區(qū)突變菌株。本研究檢出的17株泰利唑胺不敏感的糞腸球菌中有11株攜帶外源性質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因optrA(編碼ABC家族F亞家族蛋白)。結(jié)合既往曾有報道[11]顯示，攜帶optrA基因的糞腸球菌對泰利唑胺具有耐藥性，推測攜帶optrA基因是本研究中糞腸球菌對泰利唑胺不敏感的主要機(jī)制。但另外6株泰利唑胺不敏感的糞腸球菌并未檢出相關(guān)耐藥基因，是否存在其他未知機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

多重耐藥糞腸球菌的出現(xiàn)給臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)，惡唑烷酮類藥物的合理使用和適當(dāng)?shù)尼t(yī)院感染防控非常重要。在本研究中，泰利唑胺對攜帶optrA基因的糞腸球菌菌株未顯示出明顯的優(yōu)勢。隨著利奈唑胺使用的日益增長，第二代惡唑烷酮類藥物泰利唑胺不敏感糞腸球菌菌株的出現(xiàn)也有逐漸增加的風(fēng)險。由于本研究為單中心數(shù)據(jù)，且該院尚未使用泰利唑胺，仍需要更多的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證泰利唑胺對糞腸球菌感染的療效。