孫繼民,宋秀平,傅桂明,魯 亮,劉起勇

浙江省鼠形動物巴爾通體的遺傳進(jìn)化分析＊

孫繼民1,2,宋秀平1,傅桂明2,魯 亮1,劉起勇1

目的 分析浙江省鼠形動物中巴爾通體分子遺傳進(jìn)化關(guān)系,為巴爾通體人群感染的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。方法用夾夜法在浙江省不同地區(qū)、不同季節(jié)捕獲鼠形動物,無菌操作取鼠肝和脾,用PCR和分離培養(yǎng)檢測巴爾通體,對部分陽性產(chǎn)物測序,提交到 GenBank,用CLUSTAL W進(jìn)行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10軟件構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系,分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果我們分別從黑線姬鼠、黃毛鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、社鼠、臭鼩鼱、東方田鼠、黃胸鼠和大林姬鼠中檢測到巴爾通體特異DNA片段,浙江首次從黑線姬鼠脾中分離出一株巴爾通體。遺傳進(jìn)化分析顯示我們檢測到的巴爾通體與Bartonella rattim assiliensis以及對人類有致病性的B.graham ii的遺傳關(guān)系最近。結(jié)論浙江省鼠類中廣泛存在巴爾通體感染,而且攜帶人類致病性巴爾通體,存在人群感染風(fēng)險。

鼠形動物;巴爾通體;遺傳進(jìn)化分析

巴爾通體是一類革蘭氏陰性菌,可侵襲宿主的紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞〔1〕,目前巴爾通體包括21個種及亞種,其中至少12種已知可致人類疾病〔2〕。這類細(xì)菌的致病譜非常廣,五日熱巴爾通體(Bartonella quintana)可引起戰(zhàn)壕熱、心內(nèi)膜炎、桿菌性血管瘤〔3〕和流浪人群的菌血癥〔4〕;漢賽巴爾通體 (B.henselae)可以導(dǎo)致桿菌性血管瘤〔5-6〕和心內(nèi)膜炎〔7-8〕以及最常見的貓抓病〔9-10〕;桿菌狀巴爾通體可以引起秘魯疣(verruga peruana)和奧羅亞熱(Oroya fever)〔11〕,近年來 B.vinsonii Sub sparupensis〔12〕和B.tam iae等數(shù)種巴爾通體也先后被報導(dǎo)可對人類致病。

據(jù)臨床報道,浙江省貓抓病病例數(shù)在國內(nèi)僅次于江蘇,據(jù)第二位,而且浙江省經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá),風(fēng)景優(yōu)美,有眾多的商貿(mào)中心和旅游景點。然而,目前尚沒有從浙江地區(qū)分離出巴爾通體的報導(dǎo),我們也不清楚鼠類的感染情況以及所攜帶巴爾通體是否可對人類致病。所以有必要對浙江省鼠類中巴爾通體感染情況進(jìn)行調(diào)查,并弄清其所攜帶巴爾通體的種類可對人類致病,為保障人類健康提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 2005年12月至2006年12月,分別在天臺、金東、龍泉、臨海、淳安、上虞、龍游、甌海、建德和江山等10個縣區(qū)的丘陵、山區(qū)、農(nóng)場、區(qū)民區(qū)等生境用夾夜法捕獲鼠形動物,所有的鼠形動物分類鑒定,然后無菌操作取肝和脾,置于1.5m L滅菌離心管中,-20℃保存。記錄每只鼠形動物的背景資料,包括編號、采集時間、地點、生境、鼠種、雌雄、體重、頭體長、尾長、耳高等背景資料。

1.2 分離培養(yǎng) 隨機(jī)選取10份樣本進(jìn)行分離培養(yǎng),每份樣本取25mg鼠形動物的肝脾用研缽研碎,然后加入200μL滅菌胰酶大豆肉湯研成勻漿,接種于含5%脫纖維羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基上,至于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,每天觀察其生長情況并記錄,最長達(dá)45d。為預(yù)防交叉感染,每只動物的標(biāo)本單獨用一個研缽,研缽用后高壓滅菌后清洗。

1.3 DNA提取

1.3.1 臟器DNA提取 將臟器研磨后,采用Q IAGEN核酸提取試劑盒,將按照說明書逐步提取DNA。

1.3.2 菌落DNA提取 挑取疑似且革蘭染色鏡下見陰性小桿菌的菌落,收集于含100μL去離子水(p H 8.0)的1.5 mL離心管中,混勻,100℃煮10 min,50 000 r/min離心5 min,上清液即為模板,制成模板后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR及電泳檢測 反應(yīng)體系25μL,模板DNA加3μL,10μmol/L引物1μL,Taq DNA 聚合酶1.5 U,10 ×buffer 2.5μL,20 mmol/L M g2+1.5μL,2.5 mmol/L dNTP 2μL,加去離子水至25μL,反應(yīng)使用PTC2150型DNA儀(MJ Research Inc,Watertow n,MA),反應(yīng)用引物見表1。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物,加入1μL電泳載樣液,1%瓊脂糖電泳(4 V/cm)40 min,紫外燈下觀察并拍照。

為避免標(biāo)本污染引起假陽性反應(yīng),標(biāo)本處理、反應(yīng)液制備、PCR擴(kuò)增以及產(chǎn)物分析在不同區(qū)域進(jìn)行,加樣器和移液器分開專用,PCR反應(yīng)同時設(shè)立陽性對照和空白對照(去離子水)。兩對引物擴(kuò)增產(chǎn)物均陽性判為陽性,如果只有一對為陽性則判為陰性。

表1 PCR反應(yīng)引物Tab.1 Sequnences of primers

1.5 PCR陽性產(chǎn)物克隆及測序 gltA基因巴爾通體的遺傳學(xué)分類標(biāo)志〔5〕,為進(jìn)一步鑒定所檢測到的DNA序列,我們選取8例 PCR檢測陽性和1例分離菌株的gltA引物擴(kuò)增產(chǎn)物用Promega的純化試劑盒純化,然后按照廠家說明書用p GEM-T Easy載體克隆。挑取白色菌落由六合通公司進(jìn)行測序,預(yù)計測序產(chǎn)物長度為379bp。

1.6 序列比對及數(shù)據(jù)分析 將所得序列與 Gen-Bank中記錄的巴爾通體種類的相同基因進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析,所有序列數(shù)據(jù)用CLUSTAL W進(jìn)行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10軟件構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系,分析方法為最大簡約法。以布魯氏菌(Brucella abortus)作為外群。

2 結(jié) 果

2.1 捕獲動物情況 全省共捕獲427只動物,捕獲數(shù)最多的是天臺229只,其次是龍泉76只,其余地區(qū)均低于50只。所捕獲鼠形動物的種類包括192只黑線姬鼠、28只社鼠、45只黃毛鼠、27只鼩鼱、7只黃胸鼠、43只褐家鼠、9只小家鼠、37只黑腹絨鼠、9只東方田鼠、23只臭鼩鼱和7只大林姬鼠。雌性230只,雄性197只。

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果 從選取的10份樣本中分離出1株巴爾通體,該樣本來自天臺的一只黑線姬鼠。

2.3 PCR檢測結(jié)果 共檢測出134份陽性,其中陽性率最高的縣區(qū)是臨海為56.3%,龍游和甌海也達(dá)到40%,樣本量最多的天臺陽性率為37.1%。檢測陽性的鼠種包括黑線姬鼠、社鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、東方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠,我們沒能在鼩鼱和小家鼠中檢測到陽性。雌性的陽性率為30.9%,雄性的陽性率為32%。

2.4 測序結(jié)果 8例PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)測序后提交到 GenBank后的注冊號分別為 EU 179229、EU 179230、 EU 179231、EU 179232、 EU 179233、EU 179234 、EU179235和 EU 179236。

2.5 遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)gltA基因的進(jìn)化分析,我們測得的序列聚為兩個群,但這兩個群之間的相似度大于 98%,這兩個群與 B.graham ii和 B.Rattimassiliensis的遺傳關(guān)系最近(圖1)。第一個群中,R29ZJ、R60ZJ、R17ZJB、R2ZJJD 和 R3ZJJD的序列完全一致,并且與Ac1692yn(A F391271)、Ad1734yn(AF391278)和 A l1714yn(AF391280)的相似度達(dá)到99%,這幾個序列分別來自云南的西南姬鼠,、龍姬鼠和四川姬鼠 (Bai et al.,2002)。R21ZJ和R66ZJB的序列僅有一個堿基不用,R21ZJ第131位為T,R66ZJB相應(yīng)位置為C,R1ZJB的序列與 R21ZJ也僅在338位有一個不同(C→T),這三個序列與美國西部白腹食蝗鼠血中檢測到的巴爾通體菌株 OL 11554ks(DQ 357612)相似度大于95%(Ying Bai et al.,2007),他們與 B.graham ii(A Y584855)的相似度為96%(圖1)。

圖1 巴爾通體遺傳進(jìn)化分析圖Fig.1 Phylogenctlc anahysis of Bartonellassp

3 討 論

巴爾通體宿主動物廣泛,除了貓、犬和牛等與人類關(guān)系密切的動物外,野生鼠形動物也是巴爾通體的重要自然宿主,是巴爾通體最大的貯存宿主。調(diào)查顯示英格蘭和美國東南部鼠形動物的巴爾通體感染率分別為 62.2%(23/37)和 42.7%(119/279)〔13-14〕。據(jù)我們所知,目前檢測到巴爾通體的鼠形動物至少包括褐家鼠、黃胸鼠、屋頂鼠、小家鼠、大林姬鼠、日本姬鼠、黃喉姬鼠、小林姬鼠、黑線姬鼠、歐鼠、田鼠、拉布拉多白足鼠、小花鼠、金背黃鼠、加州黃鼠、細(xì)足林鼠、白喉林鼠、Sorex vulgaris、鼩鼱、大絨鼠、斯氏家鼠、錫金小鼠、灰麝鼩、大足鼠和臭鼩鼱等〔15-23〕。目前已經(jīng)有多種巴爾通體從小型獸類中分離出,例如 B.tribocorum,伊麗莎白巴爾通體 ,B.graham ii、B.tay lorii、B.vinsonii vinsonii、B.w ashoensis、B.doshiae、B.birtlesii、B.vinsonii arupensis、 B. rattimassiliensis、 B.Phoceensis等〔24〕。

我們檢測到的巴爾通體與B.Rattim assiliensis的遺傳關(guān)系最近,但更重要的是它們與人類致病性巴爾通體B.graham ii的遺傳關(guān)系也非常近。這就提示我們浙江省鼠形動物所攜帶的巴爾通體可以對人類致病,存在感染人的風(fēng)險。

在本研究中,我們從黑線姬鼠、社鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、黑腹絨鼠、東方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠中檢測到了巴爾通體,從黑線姬鼠的樣本中分離出一株巴爾通體,這是首次從浙江的樣本中分離出巴爾通體,對浙江省巴爾通體的研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述,我們從浙江省不同地區(qū)不同鼠種的樣本中均檢測到了巴爾通體,根據(jù)遺傳進(jìn)化分析所檢測到的巴爾通體與B.graham ii和B.Rattim assiliensis的遺傳關(guān)系最近,首次從浙江分離出巴爾通體,為浙江省巴爾通體的預(yù)防控制提供了科學(xué)依據(jù)。

〔1〕Boulouis HJ,Chang CC,Henn JB,et al.Facto rs associated with rapid emergence of zoonotic Bartonella infections〔J〕.Vet Res,2005,36:383-410.

〔2〕Henn JB,Gabriel MW,Kasten RW,et al.Gray foxes(U rocyon cinereoargenteus)as a potential reservoir of a Bartonella clarridgeiae-like bacterium and domestic dogs as part of a sentinel system for surveillance of zoonotic arthropod-borne pathogens in northern California〔J〕.J Clin Microbiol,2007,45:2411-2418.

〔3〕Maurin M,Raoult D.Bartonella(Rochalimaea)quintana infections〔J〕.Clin Microbiol Rev,1996,9:273-292.

〔4〕Brouqui P,Lascola B,Roux V,et al.Chronic Bartonella quintana bacteremia in homeless patients〔J〕.N Engl JMed,1999,340:184-189.

〔5〕Koehler JE,Quinn FD,Berger TG,et al.Isolation of Rochalimaea species from cutaneous and osseous lesions of bacillary angiomatosis〔J〕.N Engl JMed,1992,327:1625-1631.

〔6〕Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,et al.16S ribosomal DNA amp lification for phylogenic study〔J〕.J Bacteriol,1991,173:697-703.

〔7〕Drancourt M,Birtles R,Chaumentin G,et al.New serotype of Bartonella henselae in endocarditis and cat scratch disease〔J〕.Lancet,1996,347:441-443.

〔8〕Hadfield TL,Warren R,Kass M,et al.Endocarditis caused by Rochalimaea henselae〔J〕.Hum Pathol,1993,24:1140-1141.

〔9〕Dolan MJ,Wong M T,Regnery RL,et al.Syndrome of Rochalimaea henselae adenitis suggesting cat scratch disease〔J〕.Ann Intern Med,1993,118:331-336.

〔10〕Regnery RL,Olson JG,Perkins BA,et al.Serological response to“Rochalimaea henselae”antigen in suspected catscratch disease〔J〕.Lancet,1992,339:1443-1445.in Japan〔J〕.App l Environ Microbiol,2008,74:5086-5092.

〔18〕Knap N,Duh D,Birtles R,et al.Molecular detection of Bartonella species infecting rodents in Slovenia〔J〕.FEMS Immunol M ed Microbiol,2007,50:45-50.

〔19〕Kosoy M,M urray M,Gilmo re RD Jr,et al.Bartonella Strains from Ground squirrels are identical to Bartonella w ashoensis isolated from a Human patient〔J〕.J Clin Microbiol,2003,41:645-650.

〔20〕Mo rw ay C,Kosoy M,Eisen R,et al.A longitudinal study of Bartonella infection in populations of wood rats and their fleas〔J〕.J Vecto r Ecol,2008,33:353-364.

〔21〕栗冬梅,俞東征,劉起勇,等.云南省不同環(huán)境鼠形動物巴爾通體感染情況的研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2004,25(11):934-937.

〔22〕白鶴鳴,楊發(fā)蓮,楊慧,等.云南省西部地區(qū)鼠群中巴爾通體感染的調(diào)查〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2005,26(11):868-870.

〔23〕葉曦,姚美琳,李國偉.福建省鼠形動物巴爾通體感染的調(diào)查〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2006,22(8):779-781.

〔24〕Gundi VA,Davoust B,Khamis A,et al.Isolation of Bartonella rattimassiliensis sp.nov.and Bartonella phoceensis sp.nov.from European Rattus norvegicus〔J〕.J Clin Microbiol,2004,42:3816-3818.

〔11〕Kreier JP,Ristic M.The biology of hemotrophic bacteria〔J〕.Annu Rev Microbiol,1981,35:325 338.

〔12〕Welch DF,Carroll KC,Hofmeister EK,et al.Isolation of a new subspecies,Bartonella vinsonii subsp.arupensis,from a cattle rancher:identity with isolates found in conjunction with Borrelia burgdorferi and Babesia microti among naturally infected mice〔J〕.J Clin Microbiol,1999,37:2598-2601.

〔13〕Birtles RJ,Harrison TG,Molyneux DH.Grahamella in small woodland mammals in the U.K.:isolation,prevalence and host specificity〔J〕.Ann Trop Med Parasitol,1994,88:317-327.

〔14〕Kosoy M Y,Regnery RL,Tzianabos T,et al.Distribution,diversity,and host specificity of Bartonella in rodents from the southeastern United States〔J〕.Am J Trop Med Hyg,1997,57:57-588.

〔15〕Engbaek K,Law son PA.Identification of Bartonella species in rodents,shrew s and cats in Denmark:detection of two B.henselae variants,one in cats and the other in the long-tailed field mouse〔J〕.APM IS,2004,112:336-341.

〔16〕Holmberg M,Mills JN,M cGill S,et al.Bartonella infection in sylvatic smallmammals of central Sweden〔J〕.Epidemiol Infect,2003,130:149-157.

〔17〕Inoue K,Maruyama S,Kabeya H,et al.Prevalence and genetic diversity of Bartonella species isolated from wild rodents

Phylogenetic analysis of Ba rtonella spp.from rodents of Zhejiang Province

(State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention,National Institute for Infectious Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

SUN Ji-min,SONG Xiu-ping,FU Gui-ming,LU Liang,L IU Qi-yong

To identify Bartonella spp.from rodents of Zhejiang Province and provide scientific basis for the control and prevention of Bartonella infection in human,murine-like animals were cap tured by night trapping method and their liver and spleen were collected to detect Bartonella by PCR and isolating culturemethod.Part of positive amp liconswere sequenced and submitted to GenBank and phylogenetic analysis was performed by comparison of g ltA fragments with PAUP 4.0 beta 10.Bartonella DNA was detected in 46.9%Samp les of A podemus agrarius,Rattus losea,Rattus norvegicus,Eothenom ysmelanogaster,Niviventer confucianus,Suncusm urinus,M icrotus fortis,Rattus flavi pectus,and Apodem us speciosus.Furthermore,the first Bartonella spp.was isolated from Apodem us agrarius in Zhejiang Province in this study.Phylogenetic analysis showed that the sequenceswere similar to Bartonella rattimassiliensis and Bartonella graham ii.It’s concluded that there exists Bartonella spp.,which could infect human,in small rodents of Zhejiang Province.

murine-like animal;Bartonella spp.;phylogenetic analysis

R376

A

1002-2694(2010)06-0532-03

＊國家自然科學(xué)基金(30371246)

劉起勇,Email:liuqiyong@icdc.cn

1.中國疾病預(yù)防控制中心,傳染病預(yù)防控制所;傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,北京 102206;2.浙江省疾病預(yù)防控制中心,杭州 310051

2009-11-26;

2009-11-28