李嶠珂,吳雪瓊,陽(yáng)幼榮,梁 艷,張俊仙,李 楠,葉麗萍,梁建琴,王安生,張廣宇,張 濤,王 蘭

100091

2.武警四川省總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)一科,樂(lè)山 614000;

3.解放軍第三O九醫(yī)院消化科,北京 100091;

4.解放軍第三O九醫(yī)院血液科,北京 100091

目前結(jié)核病仍舊是人類(lèi)所面臨的最嚴(yán)重的傳染病之一,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療在結(jié)核病的防控中就顯得十分重要。目前肺結(jié)核患者的診斷主要依據(jù)病人臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查以及痰涂片查找抗酸桿菌,而痰涂片的陽(yáng)性率偏低,分枝桿菌培養(yǎng)一般需4～8w,陽(yáng)性率也較低;常用的血清學(xué)診斷、結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗(yàn)等輔助診斷方法存在很多不足,如PPD皮膚試驗(yàn)的靈敏度在活動(dòng)性肺結(jié)核中為 70%～80%,而在播散病例中則低于50%,此外,PPD是多種抗原的混合物,所含的抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗(BCG)所共有,PPD皮膚試驗(yàn)并不能鑒別結(jié)核分枝桿菌感染者和卡介苗接種者、環(huán)境分枝桿菌感染者,因此,PPD皮膚試驗(yàn)診斷結(jié)核感染的靈敏度低,特異性差。目前結(jié)核分枝桿菌感染的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)。

ELISPOT技術(shù)具有高特異度和靈敏度,已被國(guó)外廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測(cè)〔1-4〕。目前英國(guó)Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-SPOT TB試劑盒是應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌特異的6 k Da早期分泌性抗原靶(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)多肽刺激結(jié)核致敏 T淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素(IFN-γ),并應(yīng)用ELISPOT方法檢測(cè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞〔1〕。本研究應(yīng)用CFP10/ESAT6融合蛋白作為刺激劑,建立了新的ELISOPT技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法,檢測(cè)健康體檢者、非結(jié)核疾病患者和臨床確診的初治結(jié)核病患者,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 正常對(duì)照組 解放軍第三O九醫(yī)院健康體檢者30例,年齡 18～22歲,平均年齡19.2歲。

1.1.2 非結(jié)核疾病組 消化內(nèi)科及血液科住院病人38例,其中確診為消化道潰瘍 11例,白血病8例,慢性胃炎4例,膽囊炎4例,腸梗阻3例,結(jié)腸息肉、消化道腫瘤、再生障礙性貧血和骨髓異常增生綜合征各2例;男性22例,女性16例,年齡19-81歲,平均年齡51.9歲。

1.1.3 結(jié)核病組 全軍結(jié)核病研究所確診初治結(jié)核病40例,其中肺結(jié)核27例,肺結(jié)核合并胸膜炎8例,肺結(jié)核合并腸結(jié)核4例,結(jié)核性胸膜炎1例;其中18例痰涂片抗酸染色陽(yáng)性或痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性,肺結(jié)核合并糖尿病3例;男性24例,女性16例,年齡14～72歲,平均年齡37.6歲。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑 (1)美國(guó)CTL公司酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀:由CTL公司中國(guó)銷(xiāo)售部提供免費(fèi)檢測(cè);(2)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板:美國(guó)MILIPOR公司產(chǎn)品;(3)CFP10/ESAT6融合蛋白:由本研究所提供〔5〕;(4)結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD):北京祥瑞生物制品有限公司;(5)鏈親和素-堿性磷酸酶:美國(guó) Promega公司;(6)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,簡(jiǎn)稱(chēng)BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(nitro blue tetrazolium,簡(jiǎn)稱(chēng)NBT)底物:美國(guó)Promega公司;(7)人 IFN-γ捕獲抗體和人IFN-γ檢測(cè)抗體:美國(guó)R﹠D公司;(8)植物血凝素(PHA):美國(guó)Sigma公司。

1.3 ELISPOT檢測(cè)方法

1.3.1 包被微孔板 每孔加入50μL 1∶60稀釋的IFN-γ捕獲單克隆抗體,4。C冰箱過(guò)夜。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及計(jì)數(shù) 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴細(xì)胞分層液分離、提純單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.0×106/L。

1.3.3 分泌IFN-γ的T細(xì)胞檢測(cè) 每個(gè)測(cè)試樣本需要微孔板4孔:在陰性對(duì)照孔內(nèi)加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液50μL;在陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)加入陽(yáng)性對(duì)照PHA 50μL;在2個(gè)測(cè)試孔內(nèi)分別加入CFP10-ESAT6融合蛋白50μL。分別在上述各孔內(nèi),加100μL含有2×105個(gè)PBMC的懸液,將微量板置于37。C含5%C02孵箱中孵育20h;棄培養(yǎng)上清,用 200μL 1×PBS洗板4次,1min/次;每孔加入 50μL 1∶60稀釋的IFN-γ檢測(cè)抗體,37。C孵育2h;洗板后,每孔加入50μL 1∶1 000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶,室溫孵育 2h;洗板后,每孔加入50μL新鮮配制的BICP/NBT底物,顯色15min;可見(jiàn)板底顯示紫色斑點(diǎn),用蒸餾水洗板中止反應(yīng)。每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)分泌γ干擾素的T細(xì)胞,應(yīng)用CTL公司酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)。

1.3.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 陰性孔和陽(yáng)性孔起質(zhì)控作用,如陰性孔點(diǎn)數(shù)＞10,說(shuō)明可能存在細(xì)菌污染;如陽(yáng)性孔斑點(diǎn)數(shù)＜20,說(shuō)明可能存在細(xì)胞數(shù)量或活力不足。取PPD皮試陰性的正常人的(檢測(cè)孔SFC數(shù)-陰性對(duì)照孔SFC數(shù))平均值+2s作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn),因此,當(dāng)陰性對(duì)照孔點(diǎn)數(shù)＜8,檢測(cè)孔點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔點(diǎn)數(shù)≥8,可判斷所檢測(cè)標(biāo)本為陽(yáng)性;如果陰性對(duì)照孔點(diǎn)數(shù)≥8,檢測(cè)孔點(diǎn)數(shù)為陰性對(duì)照孔兩倍,可判斷所檢測(cè)標(biāo)本為陽(yáng)性。

1.4 PPD皮膚試驗(yàn)方法 吸取PPD 0.1mL(5IU),采用曼圖氏法注射于前臂掌側(cè)皮內(nèi)。于注射后72h檢查注射部位反應(yīng)。若硬結(jié)的橫徑及縱徑的平均數(shù)≥5mm為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率表示,進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩樣本率的比較采用χ2分割法,P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建立ELISPOT檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法 為了研究ELISPOT方法的適宜實(shí)驗(yàn)條件,比較結(jié)核病人 1×105、2×105、3×105的 PBMC 經(jīng)CFP10/ESAT6融合蛋白刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù),結(jié)果顯示2×105以上的PBMC可產(chǎn)生理想的細(xì)胞斑點(diǎn);由于應(yīng)用2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)時(shí),結(jié)核病患者檢測(cè)孔的斑點(diǎn)數(shù)足夠多又不很密集,便于計(jì)數(shù);而應(yīng)用3×105個(gè)細(xì)胞數(shù)時(shí),結(jié)核病患者檢測(cè)孔的斑點(diǎn)數(shù)多而密集,不好計(jì)數(shù);此外,3×105的PBMC需要抽取更多的外周血,因此確定2×105個(gè)PBMC為每孔細(xì)胞數(shù)。比較PBMC與CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育10h、20h、30h后所產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù),結(jié)果顯示孵育20h和30h均可獲得滿意的結(jié)果;選取2×105個(gè)結(jié)核病人PBMC,比較PBMC 與 10μg/mL、20μg/mL 、40μg/mL CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育 20h后所產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù),結(jié)果顯示20μg/mL 和40μg/mL抗原濃度無(wú)明顯區(qū)別。因此,本研究確定ELISPOT方法的實(shí)驗(yàn)條件為:PBMC為2×105個(gè),CFP10/ESAT6融合蛋白濃度為 20～40μg/mL,孵育時(shí)間為20h。

2.2 應(yīng)用ELISPOT方法與PPD皮試方法檢測(cè)結(jié)核感染的結(jié)果比較 應(yīng)用PPD皮試方法及ELISPOT方法檢測(cè)108例人血樣本的結(jié)果見(jiàn)表1。PPD皮試檢測(cè)30例健康體檢者、38例非結(jié)核疾病患者和40例結(jié)核病患者的陽(yáng)性率分別為40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為20.0%、10.5%、92.5%。3組陽(yáng)性率經(jīng)列表卡方檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=59.79,P＜0.05)。將各組的陽(yáng)性率采用χ2分割法檢驗(yàn),正常對(duì)照組與結(jié)核疾病組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.03,P＜0.01),正常對(duì)照組與非結(jié)核疾病組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.20,P＞0.05),結(jié)核疾病組與非結(jié)核疾病組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.52,P＜0.01)。將40例結(jié)核病患者的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果與PPD皮膚試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn)(見(jiàn)表2),兩組間檢測(cè)結(jié)果有顯著性差別(χ2=4.08,P＜0.05)。

表1 應(yīng)用PPD皮膚試驗(yàn)和ELISPOT方法檢測(cè)108例人血樣本的結(jié)果Table 1 The result of 108 samples detected by PPD skin test and ELISPOT

2.3 應(yīng)用ELISPOT方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)結(jié)核病患者的結(jié)果比較 將40例結(jié)核病患者的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果與痰涂片或痰培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn),痰菌陽(yáng)性組ELISPOT的靈敏度為94.4%,痰菌陰性組ELISPOT的靈敏度為90.9%,兩組間ELISPOT檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異(χ2=0.002,P＞0.05),見(jiàn)表 3。

表2 結(jié)核疾病組ELISPOT方法與PPD皮試方法檢測(cè)結(jié)果的比較Table2 Comparison of 40 TB patients detected by PPD skin test and ELISPOT

表3 結(jié)核疾病組ELISPOT檢測(cè)與痰菌檢查結(jié)果的比較Table3 Comparison of 40 TB patients detected by sputumsmear or-culture and ELISPOT

3 討 論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),ESAT6和CFP10是由RD1區(qū)編碼,該區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少數(shù)致病性分枝桿菌基因組中,所有卡介苗菌株及大多數(shù)非致病性分枝桿菌基因組中均缺乏該區(qū)域〔6-7〕。因此,ESAT-6和CFP-10可作為結(jié)核分枝桿菌感染的特異性T細(xì)胞刺激抗原。經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的T-SPOT TB試劑盒是應(yīng)用一系列ESAT-6和CFP-10多肽刺激T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素〔3〕,由于一系列多肽合成的費(fèi)用高,使試劑盒成本和檢測(cè)費(fèi)用增高。Hill等〔4〕的研究表明 ESAT-6/CFP-10融合蛋白作為T(mén)淋巴細(xì)胞刺激劑可取得同樣的檢測(cè)效果,本文采用CFP10/ESAT6融合蛋白進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)的結(jié)果也證明了這一點(diǎn),但通過(guò)基因工程大量制備重組蛋白的費(fèi)用卻明顯低于多肽的合成,故本方法極大地降低了檢測(cè)的費(fèi)用。

本試驗(yàn)用ELISPOT檢測(cè)40例臨床已確診結(jié)核病患者的靈敏度(92.5%)顯著高于 PPD(72.5%),與 Codecasa等〔8〕的研究結(jié)果相似 。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用ELISPOT方法檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感性可達(dá)到78%～100%,特異性可達(dá)到80%～100%〔9〕,在HIV陽(yáng)性的結(jié)核病患者中其敏感性也可達(dá)到90%〔10-11〕。由于結(jié)核潛伏感染者的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn),無(wú)法評(píng)價(jià)PPD皮膚試驗(yàn)和ELISPOT的特異性,不能排除ELISPOT陽(yáng)性而PPD皮膚試驗(yàn)陰性者為結(jié)核潛伏感染者的可能。本文非結(jié)核疾病對(duì)照組中包括消化系統(tǒng)疾病、血液病和腫瘤患者,以及老年人,可能部分患者由于免疫功能低下,導(dǎo)致PPD皮膚試驗(yàn)假陰性,而ELISPOT方法不受患者免疫功能的影響,仍可檢測(cè)出10.5%的結(jié)核潛伏感染者。30例正常對(duì)照組的PPD和ELISPOT陽(yáng)性率分別為40.0%和20.0%,我國(guó)第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示PPD皮膚試驗(yàn)的陽(yáng)性率為45.5%〔12〕,與本文相似,而ELISPOT 的陽(yáng)性率顯著低于PPD皮膚試驗(yàn)很可能是因?yàn)榭ń槊缃臃N者被排除了,因此,ELISPOT檢測(cè)結(jié)果可能反映的是我國(guó)真正的結(jié)核菌感染率,也就是說(shuō),目前我國(guó)的結(jié)核菌感染者可能并沒(méi)有那么多。

我們對(duì)痰菌陽(yáng)性與陰性結(jié)核病人的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果分析表明,菌陽(yáng)和菌陰結(jié)核病患者的靈敏度無(wú)顯著性區(qū)別,這對(duì)于臨床上大部分痰菌陰性的結(jié)核病患者及肺外結(jié)核病患者的診斷具有重要的實(shí)際意義,可作為痰菌陰性結(jié)核病輔助診斷的重要方法。另外,ELISPOT在HIV感染者、免疫力低下者、兒童結(jié)核和肺外結(jié)核的檢測(cè)中也可獲得滿意的結(jié)果〔13-14〕。

在本試驗(yàn)的技術(shù)操作中應(yīng)注意一些問(wèn)題,固相支持物的選擇和準(zhǔn)備,試驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞的分離和孵育,試驗(yàn)中試劑的用量,抗體的濃度,劑量及每次作用時(shí)間都會(huì)造成背景和敏感性的差異,故需建立規(guī)范化的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)?？傊?CFP10/ESAT6融合蛋白作為抗原應(yīng)用于ELISPOT法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染有較高的靈敏度和特異度,可能成為結(jié)核分枝桿菌感染的一項(xiàng)重要的篩查工具,并輔助結(jié)核病診斷。

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