逯兆喜,吳 亮,陳盛霞,曹建平

隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲。隱孢子蟲感染人類后,主要寄生于消化道上皮細(xì)胞,引起隱孢子蟲病(cryptosporidiosis),癥狀包括腹痛、腹瀉和消瘦等,是WHO認(rèn)定的6種常見感染性腹瀉的病因之一。免疫功能正?；颊?腹瀉通常呈自限性,2～3w可自行消失;但免疫功能低下(嬰幼兒)和免疫功能缺陷(AIDS等)患者的腹瀉則會導(dǎo)致嚴(yán)重后果,甚至可致死亡〔1〕。細(xì)胞凋亡作為清除胞內(nèi)病原體的一種有效措施,在宿主對抗病原體感染中具有重要作用。同時,許多胞內(nèi)寄生蟲,如弓形蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、隱孢子蟲等可采用多種手段調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡從而有利于其寄生生活〔2〕。本文對隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡及意義

凋亡是細(xì)胞死亡的內(nèi)在機(jī)制,受多種信號通路調(diào)節(jié),在清除受損細(xì)胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及促進(jìn)機(jī)體成熟過程中起重要作用。此外,凋亡作為一種重要的防御機(jī)制,可對抗病毒、細(xì)菌及寄生蟲感染。

Chen等首次報道微小隱孢子蟲(C.parvum)感染可致膽管上皮細(xì)胞凋亡〔3〕。Ojcius等報道微小隱孢子蟲感染HCT-8(human ileocecal adenocarcinoma cell line,人回盲腸腺癌細(xì)胞系)細(xì)胞后,可致細(xì)胞凋亡,且凋亡率隨蟲體感染量的增加而增加〔4〕。Widmer等研究表明微小隱孢子蟲感染可致MDBK(Madin Darby bovine kidney,牛腎細(xì)胞)及 HCT-8細(xì)胞凋亡,并降低細(xì)胞貼壁能力。當(dāng)培養(yǎng)液中加入Caspase(半胱氨酸蛋白酶)抑制劑后,細(xì)胞脫落量顯著減少,但未增加細(xì)胞中蟲體數(shù)量;而用層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板時,可減少細(xì)胞脫落量并增加細(xì)胞感染率。這說明感染早期細(xì)胞脫落及凋亡不利于隱孢子蟲存活〔5〕。McCole等研究發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染Caco-2(colonic adenocarcinoma cell line,結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)和HCT-8細(xì)胞后,可致細(xì)胞中度凋亡,但可抑制星狀孢子素、依托泊苷和5-氟尿嘧啶等凋亡誘導(dǎo)劑所致的細(xì)胞凋亡〔6〕。Liu等研究表明微小隱孢子蟲感染早期(6 h和12 h)抗凋亡基因上調(diào),促凋亡基因下調(diào);感染晚期(24、48和72 h)促凋亡基因上調(diào),抗凋亡基因下調(diào)〔7〕。此外,Sasahara等研究發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲可致小鼠回腸上皮細(xì)胞凋亡〔8〕。

由此可見,隱孢子蟲可通過調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡,以促進(jìn)自身發(fā)育和增殖。此外,微小隱孢子蟲感染所致細(xì)胞凋亡可能與愛滋病患者硬化性膽管炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔3〕;并可能破壞細(xì)胞間緊密連接及細(xì)胞屏障功能,增加腸粘膜通透性,致患者嚴(yán)重腹瀉,甚至死亡〔9-10〕。

2 隱孢子蟲感染宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制

目前已知的參與隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子主要包括Fas/FasL 、Caspases、核因子-κ B(nuclear factor-kappa B,NF-κ B)以及 Tat(transactivator of transcription,Tat,反式轉(zhuǎn)錄激活因子)蛋白、生存素、骨保護(hù)素和表皮生長因子等其他凋亡相關(guān)因子。

2.1 Fas/FasL在隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡中的作用 死亡受體Fas(又稱APO-1/CD 95) 屬于腫瘤壞死因子α受體家族成員,FasL(Fas ligand)為Fas的配體。Fas/FasL是目前研究得較清楚的外源性凋亡途徑。Fas具有3個富含半胱氨酸的胞外區(qū)和1個稱為死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain,DD)的胞內(nèi)區(qū)。FasL與 Fas結(jié)合后,Fas三聚化使胞內(nèi)的DD區(qū)構(gòu)象改變,與接頭蛋白FADD(Fas-associated death domain,Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域)的DD區(qū)結(jié)合;而后FADD的N端DED(death effector domain,死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)區(qū)與Caspase 8(或10)前體蛋白結(jié)合,形成 DISC(death-inducing signaling complex,死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物)。富集在一起的Caspase 8前體可在其大小亞基之間進(jìn)行切割,產(chǎn)生有活性的Caspase 8,啟動 Caspase級聯(lián)反應(yīng),使 Caspase 3、6、7激活。這3種Caspase可降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔11〕。已有研究表明Fas/FasL在原蟲(如剛地弓形蟲、克氏錐蟲等)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

Chen等報道微小隱孢子蟲感染H69細(xì)胞24 h,經(jīng) DAPI(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色可見凋亡細(xì)胞,且細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組。在感染后的24 h內(nèi),細(xì)胞凋亡率隨蟲體感染量及感染時間的增加而增加。若在微小隱孢子蟲感染前30 min將培養(yǎng)基換為含F(xiàn)as/FasL抗體或Caspase抑制劑的培養(yǎng)基,蟲體感染24 h和48 h后細(xì)胞凋亡率顯著減少,Caspase抑制劑對細(xì)胞凋亡的抑制率達(dá)80%。這表明Fas/FasL途徑是微小隱孢子蟲致細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。進(jìn)而經(jīng)Western blotting證實微小隱孢子蟲感染6 h,FasL表達(dá)量降低;而感染12 h和24 h FasL表達(dá)量顯著增加;Fas表達(dá)量僅在感染24 h顯著增加。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)微小隱孢子蟲感染的H69細(xì)胞與未感染的Fas敏感的Jurkat E6-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后,Jurkat E6-1細(xì)胞凋亡率顯著增加,而FasL抗體可完全抑制此細(xì)胞的凋亡;當(dāng)Fas抗性的Jurkat JM-3A5細(xì)胞與隱孢子蟲感染的 H69細(xì)胞共培養(yǎng)時,Jurkat JM-3A5細(xì)胞凋亡率未見增加。此外,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明,微小隱孢子蟲可增加FasL的膜遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面FasL裂解為sFasL(soluble FasL,可溶性FasL),進(jìn)而導(dǎo)致Jurkat E6-1細(xì)胞凋亡。由此推測微小隱孢子蟲通過自分泌和旁分泌途徑,以Fas/FasL依賴機(jī)制誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡(圖1〔12〕)。

圖1 微小隱孢子蟲誘導(dǎo)膽道上皮細(xì)胞凋亡模型Fig.1 Schematic model of C.parvum-induced apoptosis in biliary epithelial cells

Motta等報道微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞24 h后,感染蟲體的細(xì)胞膜表面FasL表達(dá)量顯著增加;而未感染蟲體的細(xì)胞,其膜表面FasL表達(dá)量未見改變。此外,小鼠模型實驗顯示微小隱孢子蟲感染第16d,小腸上皮細(xì)胞FasL表達(dá)量顯著增加。當(dāng)以微小隱孢子蟲感染野生型及l(fā)pr(lymphoproliferative disorder,淋巴增生性障礙)小鼠時,感染第14d CD4+細(xì)胞缺陷的野生型小鼠體重減輕,而后隨著感染時間延長體重增加,但增加速度低于對照組;而lpr及CD4+細(xì)胞缺陷lpr小鼠感染后體重增加,兩者之間無顯著性差異。這表明Fas蛋白表達(dá)可影響CD4+細(xì)胞缺陷的野生型小鼠的體重,故推測Fas依賴的未感染細(xì)胞的凋亡加劇隱孢子蟲病所致的體重減輕〔13〕。

Mele等以抗體標(biāo)記實驗,經(jīng)流式細(xì)胞儀分選微小隱孢子蟲感染及未感染細(xì)胞,結(jié)果顯示FasL僅在感染后2 h和24 h的感染細(xì)胞中表達(dá),而Fas在感染及未感染細(xì)胞中表達(dá)量無顯著差異。由此可見,微小隱孢子蟲通過Fas受體下游效應(yīng)酶調(diào)控細(xì)胞凋亡〔14〕。

2.2 Caspase級聯(lián)反應(yīng)在隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡中的作用 Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶,是細(xì)胞凋亡反應(yīng)的重要組成部分。Caspase參與的細(xì)胞凋亡反應(yīng)一般分為兩類。一類是Caspase啟動酶 ,包括 Caspase 2 、8、9 、10,位于 Caspase 級聯(lián)活化途徑上游,可通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用自我激活。另一類是 Caspase效應(yīng)酶,包括 Caspase 3、6、7,位于整個凋亡信號的下游,多種來自上游的信號最終都匯集于此。此酶可被Caspase啟動酶激活,進(jìn)而降解胞內(nèi)蛋白,使細(xì)胞不可逆地走向死亡〔15〕。

Ojcius等以 DAPI、流式細(xì)胞術(shù)及 DNA ladder實驗證實微小隱孢子蟲感染HCT-8后,細(xì)胞發(fā)生凋亡。在微小隱孢子蟲(卵囊/細(xì)胞為1∶1)感染前30 min加入Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后,可抑制細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞感染率。這表明Caspase參與微小隱孢子蟲感染所致的細(xì)胞凋亡〔4〕。Mele等研究顯示微小隱孢子蟲感染 HCT-8細(xì)胞后,Caspase 3活性在2 h顯著增加,24 h減少,48 h再次增加,54 h達(dá)高峰。經(jīng)流式細(xì)胞儀分選感染及未感染細(xì)胞后,測得Caspase 3活性在2 h時感染細(xì)胞中較高,未感染細(xì)胞較低;而在24 h時則相反。這說明在微小隱孢子蟲感染后的不同時間,Caspase 3活性不同,因而細(xì)胞凋亡率也存在差異。同時,通過免疫組化證實感染后6h、24 h、48 h和 72 h,微小隱孢子蟲的發(fā)育階段分別為卵囊和子孢子、滋養(yǎng)體和裂殖體、裂殖體和裂殖子、裂殖子和雄配子體期。由此推測隱孢子蟲在發(fā)育的不同時期,通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡基因的表達(dá),抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡,以維持自身生存〔14〕。

Liu等研究發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞24 h后Caspase 4、3、6活性增加,48 h后其活性降低;加入Caspase抑制劑未影響細(xì)胞感染率,但可顯著降低細(xì)胞凋亡率;而降低蟲體感染量(卵囊/細(xì)胞為10∶1),Caspase抑制劑可顯著降低細(xì)胞感染率。以星狀孢子素處理未感染HCT-8細(xì)胞2 h,其細(xì)胞凋亡率為60%,Caspase 3/7活性增加7倍;而微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞24 h,Caspase 3/7活性僅增加 2.5倍;然而當(dāng)微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞24 h后,再以星狀孢子素處理細(xì)胞2 h,Caspase 3/7活性未見增加。這表明微小隱孢子蟲可抑制星狀孢子素誘導(dǎo)Caspase 3/7的激活。由此推測微小隱孢子蟲可通過激活Caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但也可抑制腸上皮細(xì)胞Caspase的激活。此外,研究還發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞24 h和48 h,裂殖體和裂殖子數(shù)量無明顯改變,但滋養(yǎng)體數(shù)量增加;而當(dāng)加入Caspase抑制劑后,子孢子數(shù)量顯著增加,裂殖體數(shù)量顯著減少,滋養(yǎng)體數(shù)量僅在感染的24 h顯著增加。由此推測激活Caspase是微小隱孢子蟲生長所必須的,在感染晚期,抑制細(xì)胞凋亡和/或抑制Caspase可阻礙微小隱孢子蟲的正常發(fā)育〔7,16〕。

2.3 NF-κ B在隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡中的作用 NF-κ B是一種核蛋白因子,幾乎存在于所有細(xì)胞。靜息狀態(tài)下 ,NF-κ B 與 Iκ B(inhibitor of NF-κ B,NF-κ B抑制蛋白)以非活性形式存在于胞漿中;細(xì)胞受刺激后,IKK(Iκ B kinase,Iκ B 激酶)被激活,Iκ B經(jīng)快速磷酸化、泛素化后降解,使NF-κ B游離于胞漿中,并迅速轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi),與特定基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,啟動基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。Iκ Bα是NF-κ B最重要的調(diào)節(jié)因子,可抑制 NF-κ B的激活。當(dāng)病原體(如小泰勒蟲)侵襲時,核轉(zhuǎn)錄因子的激活在胃腸上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在上皮細(xì)胞免疫或炎癥反應(yīng)中,轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B家族可激活多種基因,如 IFN-γ(interferon-γ,γ干擾素)、IL-8(interleukin-8,白細(xì)胞介素 8)等〔17〕。NF-κ B還可激活某些胞內(nèi)生存信號,如原癌基因(c-Myc)、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP)等,在抑制 TNF-α、Fas抗體、射線、化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用〔18〕。

Chen等以免疫印跡、電泳凝膠阻滯及免疫熒光實驗證實,NF-κ B系統(tǒng)激活僅發(fā)生于微小隱孢子蟲感染的細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致Iκ Bα蛋白降解。ELISA 結(jié)果顯示隱孢子蟲感染細(xì)胞后,可增加IL-8分泌且具有時間依賴性,而抑制劑MG-132及SN50可分別抑制 Iκ Bα蛋白降解 ,阻止 NF-κ B 與 DNA 結(jié)合 ,顯著降低IL-8分泌。DAPI染色結(jié)果表明微小隱孢子蟲感染24 h,細(xì)胞凋亡率增加,且MG-132或SN50可顯著增加微小隱孢子蟲所致H69細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步經(jīng)微小隱孢子蟲多克隆抗體及DAPI染色證實細(xì)胞凋亡僅發(fā)生于未感染細(xì)胞。由此推測微小隱孢子蟲感染直接激活NF-κ B/Iκ B途徑,抑制感染細(xì)胞凋亡,維持自身生存和繁殖;通過旁分泌途徑誘導(dǎo)未感染細(xì)胞凋亡,限制感染擴(kuò)散(圖2〔18〕)。

圖2 微小隱孢子蟲誘導(dǎo)NF-κ B激活、IL-8分泌及膽管上皮細(xì)胞凋亡模型Fig.2 Schematic model of C.parvum-induced NF-κ B activation and its relevance to IL-8 secretion from,and associated epithelial apoptosis in biliary epithelial cells

2.4 其他凋亡相關(guān)因子在隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡中的作用

2.4.1 Tat蛋白 Tat蛋白是HIV-1基因組編碼的一個重要調(diào)控蛋白,含 101個氨基酸殘基,是HIV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必須,還有旁分泌、促細(xì)胞生長、免疫抑制及內(nèi)化等多種效應(yīng)〔19〕。Tat蛋白還可抑制沙門氏菌侵入H T-29細(xì)胞。此外,表達(dá)Tat蛋白的細(xì)胞對凋亡刺激更敏感,且協(xié)同 T細(xì)胞增加FasL表達(dá),激活Fas死亡受體,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡〔20〕。

O'Hara等證實 Tat蛋白可增加胞質(zhì)中FasL表達(dá),而不影響細(xì)胞凋亡率及FasL膜遷移,但當(dāng)微小隱孢子蟲感染細(xì)胞后,FasL及細(xì)胞凋亡率隨Tat蛋白濃度的增加而增加,且細(xì)胞凋亡主要發(fā)生于未感染細(xì)胞。經(jīng)微小隱孢子蟲與Tat蛋白共存實驗證實,Tat蛋白增加感染細(xì)胞中FasL膜遷移及釋放。FasL抗體NOK1或Caspase 8抑制劑Z-IETD-fmk可抑制Tat蛋白的作用,減少細(xì)胞凋亡率。這表明Tat蛋白以FasL途徑促進(jìn)隱孢子蟲誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔21〕。

2.4.2 生存素 近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一種重要的抗凋亡因子。目前人類 IAP家族已發(fā)現(xiàn) 8個成員：c-IAP1、c-IAP2、NAIP、XIAP、Survivin、ML-IAP,Livin、Bruce(Apollon)和 ILP2。其中生存素(Survivin)是IAP家族中最小的成員,僅有一個半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP的BIR功能區(qū),此功能區(qū)可直接或間接作用于Caspase,抑制其活性,實現(xiàn)抗凋亡功能〔22〕。

Liu等研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白降低Caspase活性,且與微小隱孢子蟲感染抑制宿主細(xì)胞凋亡是同步的。通過siRNA技術(shù)敲除Survivin或XIAP可致感染24 h和48 h的Caspase 3/7活性顯著增加。然而僅敲除Survivin時,感染24 h和48 h細(xì)胞凋亡率顯著增加。這表明Survivin和 XIAP可抑制Caspase 3/7活性,但僅 Survivin抑制宿主細(xì)胞凋亡〔16〕。

2.4.3 骨保護(hù)素 骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)是一種分泌性糖蛋白,為目前已發(fā)現(xiàn)的T RAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)受體(DR4,DR5,DcR1,DcR2和OPG)中的一種。其中DR4和DR5為死亡受體,可與T RAIL結(jié)合,導(dǎo)致相應(yīng)受體三聚化,通過FADD與胞質(zhì)中Caspase 8前體蛋白結(jié)合,激活 Caspase 系統(tǒng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔21〕;而 OPG,DcR1和DcR2為死亡誘騙受體(death decoy receptor),可競爭性與 TRAIL結(jié)合,但缺乏完整的死亡結(jié)構(gòu)域,因此不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔23〕。

Gonzalez等研究表明隱孢子蟲感染人腸上皮細(xì)胞后,OPG基因表達(dá)量顯著增加,且人隱孢子蟲(C.hominis)感染的細(xì)胞OPG表達(dá)量高于微小隱孢子蟲感染的細(xì)胞。研究還發(fā)現(xiàn)感染火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)的志愿者,空腸組織中OPG表達(dá)量顯著增加。微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞1 h,OPG mRNA及上清中OPG蛋白表達(dá)量增加;感染3 h OPG mRNA表達(dá)量顯著增加;而感染12 h,OPG mRNA及上清中OPG蛋白表達(dá)量與對照組相比無顯著差異。這表明OPG mRNA及蛋白分泌增加始于感染早期,抑制細(xì)胞凋亡,有利于隱孢子蟲完成生活史。而T RAIL可顯著降低隱孢子蟲感染量,增加細(xì)胞凋亡率。由此表明OPG作為一種可溶性誘騙受體與T RAIL結(jié)合,抑制細(xì)胞凋亡〔24〕。

2.4.4 表皮生長因子 表皮生長因子(epidermal grow th factor,EGF)是由53個氨基酸組成的低分子量(6.4kD)多肽。多種組織如唾液腺、腎臟、小腸、肝臟及胰臟等可分泌EGF。EGF與特異性受體結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),如促進(jìn)細(xì)胞增殖、傷口愈合、胃腸功能成熟。曾有研究認(rèn)為EGF可有效刺激腸道修復(fù),且口服EGF抑制病原微生物在腸道的定居〔25〕。

Buret等經(jīng) Hoechst染色證實安氏隱孢子蟲(C.andersoni)感染人(SCBN和CacO2)和牛(MDBK和NBL-1)上皮細(xì)胞24 h,細(xì)胞凋亡率均顯著增加。當(dāng)隱孢子蟲感染經(jīng) rhEGF(recombinant human EGF,重組人表皮生長因子)預(yù)處理的上皮細(xì)胞后,24 h細(xì)胞感染率顯著降低,凋亡率與對照組相比無顯著差異。此外,PI(propidium iodine,碘化丙啶)及免疫熒光實驗顯示EGF不影響安氏隱孢子蟲的活力。由此推測,EGF可降低安氏隱孢子蟲感染率并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔10〕。

3 結(jié) 語

隱孢子蟲作為一種專性胞內(nèi)寄生蟲,在發(fā)育的不同時期抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡對其生存和繁殖具有重要意義。對隱孢子蟲調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的研究,有助于進(jìn)一步了解宿主與隱孢子蟲之間的關(guān)系。然而細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的過程,是多種抗凋亡和/或促凋亡因子共同作用的結(jié)果。因此,探討細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制,選擇性的抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,將為隱孢子蟲病治療提供新途徑。

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