賈萬忠,閆鴻斌,郭愛疆,史萬貴,詹 芳,付寶權

2.甘肅省動物疫病控制中心,蘭州 730046

帶科絳蟲(T aeniidae)幼蟲引起的絳蟲蚴病(Larval cestodiasis/infections with larva of cestodes)如棘球蚴病、囊尾蚴病等是一類重要的人獸共患寄生蟲病,在我國和世界各地普遍流行,危害嚴重。本文將對帶科絳蟲線粒體基因組序列分析的研究進展、應用和今后發(fā)展方向做一簡要綜述。迄今,已完成包括帶科絳蟲帶屬7個種、棘球屬絳蟲5個種(10個基因型)在內共計17個線粒體基因組全序列測定。帶科絳蟲線粒體基因組的堿基組成、基因結構、基因變異等分析結果為帶絳蟲線粒體功能基因組學研究、比較基因組學研究、分子分類學研究、分子系統(tǒng)發(fā)育進化分析及其疾病診斷等提供了重要依據(jù)和指導作用。線粒體基因組序列分析不僅有助于解決一些新近發(fā)現(xiàn)的種如亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)和石渠棘球絳蟲(Echinococcus shiquicus)獨立種的分類地位,而且為解決細粒棘球絳蟲(E.granulosus)各蟲株(基因型)如馬株(G4)和牛株(G5)等的分類學地位提供了有效途徑：馬株和牛株與普通綿羊株(G1)線粒體基因組序列差異較大,具有種間核苷酸序列的變異程度,據(jù)此應建議獨立設種。同時可根據(jù)線粒體基因組序列,通過PCR方法有效地對臨床上易混淆的帶科絳蟲的種、基因型等作出確切的鑒別和診斷,從而為帶絳蟲病的流行病學調查和防治等提供重要依據(jù)。

帶絳蟲蚴病是世界上危害嚴重的一類人獸共患寄生蟲病,由帶科絳蟲幼蟲引起〔1-3〕。帶科(Taeniidae)絳蟲隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)絳蟲綱(Cestoda),包括棘球屬(Echinococcus)和帶屬(Taenia)二個屬,曾報道的名稱種達50多個,其中一部分為同種異名,不少種內還存在一定數(shù)目的亞種、變種或者基因型等現(xiàn)象,這給帶科絳蟲的分類與鑒定等造成了困難。線粒體基因組有許多獨特的特征如動物線粒體基因組很小,獨立于胞核染色體基因組之外,但又與胞核染色體基因組緊密聯(lián)系;有相對穩(wěn)定的基因數(shù)目,基本上是母系遺傳,很少發(fā)生基因重組、基因位置的排列和遺傳密碼使用上的變化;tRNA的二級結構、堿基組成和變異等有也其自身特點。這為人們研究真核生物的起源和線粒體基因的演化提供了便利條件。線粒體基因組所有這些特征都已經(jīng)在研究動物物種的分類、基因的進化、現(xiàn)有物種的進化史等方面得到應用〔4〕。傳統(tǒng)的形態(tài)學方法有時難以對那些形態(tài)上相似、但在遺傳方面卻不同的蟲種(隱藏種)加以鑒定。18S核糖體rRNA基因(18S rDNA)、內部轉錄間隔(ITS1和ITS2)被證明是鑒定絳蟲的可靠的遺傳標記,但是用線粒體基因來代替18S rDNA和ITS作為分子遺傳標記用于分析和鑒定絳蟲種類(特別是親緣關系相近種或者蟲株)、研究基因的變異現(xiàn)象等則更為有效。亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲18S rDNA序列核苷酸的差異性僅有0.7%,主要差異僅表現(xiàn)為個別堿基發(fā)生突變和小片段序列缺失,而線粒體基因組全序列間核苷酸的差異性達5.6%,因而可根據(jù)線粒體基因組序列設計引物通過PCR方法較容易地將這兩個蟲種鑒別開來。

本文對帶科絳蟲線粒體基因組序列堿基組成、基因結構、密碼子使用、基因變異等特點,及其在分子系統(tǒng)發(fā)育、蟲種的分類鑒定和疾病診斷中的應用等方面進行綜述,以期對今后絳蟲線粒體基因組研究、分子系統(tǒng)分類、分子進化、分子診斷等提供重要的指導作用。

1 帶科絳蟲線粒體基因組的一般特征

1.1 線粒體基因組大小及堿基組成 自2000年第一個帶屬絳蟲肥頭絳蟲(T.crassiceps)線粒體基因組全序列被完整測序后,在帶屬中已另有6個種(其中我們完成 3個種)的mtDNA 被完整測序〔5-11〕;自1999年第一個棘球屬絳蟲多房棘球絳蟲(E.multiculoralis)線粒體全基因組序列被完整測序后,在棘球屬中另有4個種(包括9個蟲株或基因型),共計10個線粒體基因組全序列被測定〔12-15〕。帶科絳蟲mtDNA結構與其它后生動物相似,為雙鏈閉環(huán)分子,但更緊湊,核苷酸數(shù)目多在13.4 kb～13.8 kb之間,在目前已測序的所有后生動物線粒體基因組中,屬于最小的一類;編碼區(qū)占基因組95%左右,其中蛋白編碼區(qū)約為74%;富含 AT,含量約70%,帶屬的AT含量稍高于棘球屬AT含量,在4種堿基成分中,T含量最高,其次為A和G,C含量最低,見表1。

表1 已發(fā)表的帶科絳蟲線粒體基因組全序列及其特征

1.2 線粒體基因組的基因組成及排列 帶科絳蟲線粒體基因組共有36個編碼基因,其中編碼蛋白質的基因有12個,編碼tRNA的基因有22個(其中編碼絲氨酸-tRNA和亮氨酸-tRNA的基因有2個,其余18種tRNA分子各有1個,高度體現(xiàn)了密碼子兼并性和生物利用資源的節(jié)約原則),編碼rRNA的基因有2個。約占60%的蛋白編碼基因是用于編碼NADH-Q還原酶的 7個亞基(nad1～6及nad4L),其余的用于編碼細胞色素還原酶的1個亞基(cob)、細胞色素氧化酶的3個亞基(cox1～ 3)和ATP合成酶的1個亞基(atp6),缺少較高等動物所具有的atp8基因。此外,線粒體基因組除1～39 bp小的非編碼區(qū)外,還含有2個大的非編碼區(qū)NR1和NR2(NR1,第一非編碼區(qū),位于trnY和trnL1基因之間;NR2,第二非編碼區(qū),位于nad5和trnG基因之間)。所有基因都位于一條鏈(即重鏈)上;基因轉錄和復制按同一個方向即順時針方向進行,見圖1。這與有體腔的后生動物線粒體基因組基因的轉錄以兩個方向不對稱進行不同。蛋白質基因中沒有內含子,各蛋白質基因之間一般被tRNA基因分隔開;各個基因之間沒有基因間隔或有少數(shù)基因間隔,部分基因之間還相互重疊如nad4L和nad4基因之間。tRNA基因呈單一排列如trnH或呈簇排列如trnN-P-I-K。帶科絳蟲線粒體基因組基因序列排列與扁形動物門中吸蟲和線形動物門中線蟲相比則較穩(wěn)定、缺少變化。

圖1 帶科絳蟲線粒體基因組圖譜

1.3 tRNA的二級結構 帶科絳蟲線粒體tRNA長度約為55～76 nt,二級結構有2種形式：(1)多數(shù)(18個)為典型的三葉草結構如泡狀帶絳蟲(T.hydatigena)線粒體 trnN,見圖 2;(2)trnC、trnS1、trnS2和trnR四個則呈D-loop結構(D-環(huán),缺配對的DHU臂)如泡狀帶絳蟲線粒體精氨酸t(yī)RNA,見圖2。線粒體tRNA結構相當保守：受體臂由7個堿基對組成;反密碼子環(huán)由5個配對的堿基對形成的莖和一7個堿基的環(huán)組成,反密碼子在帶科絳蟲間高度保守;連接各環(huán)的莖之間的堿基數(shù)目也比較保守,例如三葉草結構中反密碼子環(huán)和 T Ψ C環(huán)間堿基數(shù)目多為4個(1-6個),三葉草結構tRNA的受體臂和D-環(huán)間堿基數(shù)多為2個(1～3個);D-loop結構中,非配對DHU臂堿基數(shù)為7-12個。

圖2 泡狀帶絳蟲(T.hydatigena)部分線粒體tRNA二級結構

1.4 NR1和NR2 帶科絳蟲線粒體基因組在大小上的差異在很大程度上取決于非編碼區(qū),尤其是2個主要非編碼區(qū)的大小。帶屬NR1也稱SNR(短非編碼區(qū)),其長度基本一致,為64～70 bp;NR2長度為64～194 bp,其中豆狀帶絳蟲(T.pisi f ormis)的NR2最短,只有64 bp,肥頭絳蟲(T.crassiceps)的NR2最長,為194 bp,見表2。棘球屬除細粒棘球絳蟲G1型和G4型的NR1長度與帶屬相似,而其它蟲種(株)NR1和 NR2兩者長度相近,約為180 bp。

表2 帶科絳蟲線粒體基因組兩個主要非編碼區(qū)長度變化

這些非編碼區(qū)富含反向重復序列和串聯(lián)重復序列,堿基A和T含量通常特別高(AT富集區(qū)),見圖3。該區(qū)域序列即使是親緣關系很近的扁形動物物種之間也很少有相似性,核苷酸序列差異很大。但是往往能形成富含莖—環(huán)的復雜二級結構,見圖4〔9,11-13〕。這些莖-環(huán)結構類似于脊椎動物線粒體DNA中D環(huán)區(qū)附近的3個保守序列CSB1～CSB3,可作為DNA-蛋白質結合時蛋白質(轉錄起始因子)的結合位點,因此AT富集區(qū)被認為對線粒體DNA的復制和轉錄起著調控作用〔4,16〕。

1.5 密碼子使用絳蟲的核染色體基因組采用生物體通用遺傳密碼子,而線粒體基因組采用扁形動物門的線粒體遺傳密碼子〔17-18〕,具體為：(1)除廣泛使用ATG作為起始密碼子編碼蛋氨酸外,部分基因如泡狀帶絳蟲cox3用GTG作為蛋白質翻譯的起始密碼子。(2)終止密碼子都用TAA和 TAG,有的蛋白質如豬帶絳蟲的cox1翻譯還使用T作為轉錄終止信號,轉錄后加工時在T之后再插入AA作為蛋白翻譯的終止密碼子〔8〕。TGA在核基因組中是終止密碼子,但在線粒體基因組中編碼色氨酸。(3)AGA和AGG在線粒體編碼絲氨酸而非精氨酸。(4)AAA編碼天門冬酰胺(Asn)而非賴氨酸(Lys)。

2 線粒體DNA在絳蟲分子分類學方面的應用

2.1 在棘球屬絳蟲分類學中的應用 自從Rudolphi將棘球屬(Echinococcus)正式建立獨立的一個屬以來〔19〕,棘球屬內種與種以下階元之間的分類關系就一直存在著爭論。20世紀50年代,Rausch等人將多房棘球絳蟲(E.multilocularis)、分布于南美的少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthrus)和福氏棘球絳蟲(E.vogeli)各自立為獨立種,而將散布于全世界的其他棘球絳蟲種群統(tǒng)歸為細粒棘球絳蟲(E.granulosus)之后,爭論漸趨平息,并獲得學者們的公認〔20-23〕。近來,又在我國發(fā)現(xiàn)一新種—石渠棘球絳蟲(E.shiquicus)。因此,目前公認的棘球屬絳蟲有5個種〔24〕。即使如此,棘球屬絳蟲尤其是細粒棘球絳蟲種及以下階元的分類學問題仍存在一定分歧和爭議。

關于棘球絳蟲的分類,長期以來一直以形態(tài)結構作為主要的分類指標,如果形態(tài)結構變異不能達到差異顯著性,就不能確認為一個獨立的種。后來發(fā)現(xiàn)在分類中被認為是同一個種的種下階元其致病性、流行病學特征、發(fā)育歷程等都存在著較大的區(qū)別,加之形態(tài)學分類法的不統(tǒng)一性,使得人們重新考慮棘球屬絳蟲尤其是細粒棘球絳蟲的分類方法。隨著生物技術的發(fā)展,在形態(tài)結構的基礎上結合其它特征逐漸成為分類學上解決近似種分類的一種方法。目前,棘球屬絳蟲的分子分類方法主要是基因分析方法,在揭示棘球絳蟲種株之間的關系上顯示了巨大的應用潛力。

根據(jù)基因型的差異,人們將細粒棘球絳蟲分為G1～G10十種不同基因型,與形態(tài)學、地理分布等傳統(tǒng)方法所得到的蟲株結果有良好的一致性,不同蟲株所寄生的終末宿主和中間寄主稍有不同,其致病性、地理分布等方面存在不同程度的差異〔25-27〕。棘球屬絳蟲的分類學研究必須在掌握多項指標的情況下重新鑒定種和蟲株,以揭示其生物學、遺傳學和生理學特征,了解它們在不同地域和不同宿主內的變異特點。這不僅促進寄生蟲分類學的進展,而且對人們認識棘球絳蟲和棘球蚴病的流行病學及找出合理的預防措施有十分重要的意義。

根據(jù)已完成的細粒棘球絳蟲線粒體基因組序列,表明馬株(G4)與其它蟲株間核苷酸差異在10%以上,從這個意義上講它完全具有獨立種的分類學地位 ;牛株(G5、E.ortleppi/E.felidis)與其它蟲株間的核苷酸差異在6%以上,也具有獨立種的地位。此外,除塔斯馬尼亞綿羊株(G2)和水牛株(G3)與普通綿羊株(G1)間核苷酸差異很小外,稱細粒棘球絳蟲狹義種,而G6、G7、G8和G10與普通綿羊株(G1)間核苷酸差異均超過10%,因此它們應屬于新的種〔15,28〕。

2.2 在帶屬絳蟲分類學中的應用 亞洲帶絳蟲(T.asiatica)以前曾認為是牛帶絳蟲(T.saginata)的亞種(T.saginata asiatica),因此,其是否為一個獨立種一直存在爭論。自從Jeon等通過對這兩種絳蟲的線?；蚪M全序列的測定,表明亞洲帶絳蟲與牛帶絳蟲線粒體基因組核苷酸序列的差異為5.6%,與豬帶絳蟲(T.solium)線粒體基因組序列的差異為11%,從而確定了亞洲絳蟲新種的獨立種地位和這三種絳蟲的親緣關系,并為臨床診斷和防治等工作奠定了基礎〔7-10〕。

3 在臨床分子診斷中的應用

準確的診斷、有效的防治絳蟲病取決于對病原的準確鑒定。但是,傳統(tǒng)的形態(tài)學方法有時不能對那些形態(tài)上相似、但在遺傳方面卻不同的蟲種加以鑒定。Yamasaki等利用cox1和nad1基因堿基突變位點上序列設計引物,用多重PCR方法不僅可分別擴增出大小不同的亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲cox1基因片段,而且也可分別擴增出大小不同的歐洲型和美洲型豬帶絳蟲cox1基因片段,這樣可有效地將這三種絳蟲和豬帶絳蟲基因型區(qū)別開來,這種方法為人絳蟲病流行病學調查、臨床檢測、治療及防控提供了便利〔29-31〕。

Anantaphruti等〔32〕應用 BSEE T-base reader analysis〔Base excision sequence scanning thyminebase(BESS T-base)reader analysis,堿基切除序列掃描胸腺嘧啶核苷閱讀分析〕方法通過對cox1和cob片段上特定位點上胸腺嘧啶核苷酸堿基(T)的掃描可準確地鑒別出三種帶絳蟲,并對豬帶絳蟲兩種基因型作出鑒別。該方法可以對福爾馬林保存的樣品標本進行鑒定,這極大方便了樣品的保存和處理,降低了操作者被感染的危險。LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP,環(huán)介導等溫擴增技術)也已逐漸用于宿主糞便、土壤和水源等寄生蟲DNA檢測,快速、簡便(如不需要PCR擴增儀,只需要一個恒溫水浴鍋即可)、靈敏,適宜于現(xiàn)場大規(guī)模流行病學調查和基層推廣,顯示了良好的應用潛力。Nkouawa等〔33〕以組織酶 L樣-半胱氨酸蛋白酶基因(clp)和cox1為目標靶,利用LAMP技術再結合限制性內切酶分析可以有效檢測和鑒別人體糞便中豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲三種絳蟲感染,敏感性達到從每克糞便中檢出1個拷貝的目標基因或者5個蟲卵的水平。

〔1〕蔣次鵬.我國包蟲病流行現(xiàn)況〔J〕.中國寄生蟲病防治雜志,1996,9(4)：290-294.

〔2〕Eckert J,Gemmell MA,Meslin FX,et al.WHO/OIE manual on echinococcosis in humans and animals：A public health problem of global concern〔M〕.World Organization for Animal Health,Paris,France,2001.

〔3〕 M urell KD.Epidemiology of taeniasis and cysticercosis.In Murell KD.WHO/FAO/OIE guidelines for the surveillance,prevention and control of taeniasis/cy sticercosis〔M〕.Paris：OIE,2005：32-44.

〔4〕Boore JL.Animal mitochondrial genomes〔J〕.Nucleic Acids Res,1999,27：1767-1780.

〔5〕Le TH,Blair D,Agatsuma T,et al.Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms〔J〕.Mol Bio Evol,2000,17(7)：1123-1125.

〔6〕Zarlenga DS,George M.Taeniacrassiceps：cloning and mapping of mitochondrial DNA and its application to the phenetic analy sis of a new species ofTaeniafrom Southeast A sia〔J〕.Exp Parasitol,1995,81：604-607.

〔7〕Jeon HK,Kim KH,Eom KS.Complete sequence of the mitochondrial genome ofTaenia saginata：Comparison withT.soliumandT.asiatica〔J〕.Parasitol Int,2007,56(3)：243-246.

〔8〕Nakao M,Sako Y,Ito A.The mitochondrial genome of the tapewormTaenia solium：a finding of the abbreviated stop codon U〔J〕.J Parasitol,2003,89(3)：633-635.

〔9〕Jeon HK,Lee KH,Kim KH,et al.Complete sequence and structure of the mitochondrial genome of the human tapeworm,Taenia asiatica(Platyhelminthes;Cestoda)〔J〕.Parasitology,2005,130(Pt 6)：717-726.

〔10〕Jeon HK,Eom KS.Taenia asiaticaandTaenia saginata：genetic divergence estimated from their mitochondrial genomes〔J〕.Exp Parasitol,2006,113(1)：58-61.

〔11〕Jia WZ,Yan HB,Guo AJ,et al.The complete mitochondrial geomes ofTaenia multiceps,T.hydatigenaandT.pisi formis,additional molecular markers for a tapeworm genus of human and animal health significance〔J〕.BMC Genomics,2010,in press.

〔12〕Nakao M,Yokoyama N,Sako Y,et al.The complete mitochondrial DNA sequence of the cestodeEchinococcus multilocularis(Cyclophyllidea：Taeniidae)〔J〕.Mitochondrion,2002,1(6)：497-509.

〔13〕Le T H,Pearson MS,Blair D,et al.Complete mitochondrial genomes confirm the distinctiveness of the horse-dog and sheepdog strains ofEchinococcusgranulosus〔J〕 .Parasitology,2002,124(Pt 1)：97-112.

〔14〕Yang YR,Rosenzvit MC,Zhang LH,et al.Molecular study ofEchinococcusin west-central China〔J〕.Parasitology,2005,131(Pt 4)：547-555.

〔15〕Nakao M,McManus DP,Schantz PM,et al.A molecular phylogeny of the genusEchinococcusinferred from complete mitochondrial genomes〔J〕.Parasitology,2007,134(Pt 5)：713-722.

〔16〕Pham XH,Farge G,Shi Y,et al.Conserved sequence box II directs transcription termination and primer formation in mitochondria〔J〕.J Biol Chem,2006,281(34)：24647-24652.

〔17〕Himeno H,Masaki H,Kawai T,et al.Unusual genetic codes and a novel gene structure for tRNA(AG YSer)in starfish mitochondrial DNA〔J〕.Gene,1987,56(2-3)：219-230.

〔18〕Telfo rd MJ,Herniou EA,Russell RB,et al.Changes in mitochondrial genetic codes as phylogenetic characters：two examples from the flatworms〔J〕 .Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(21)：11359-11364.

〔19〕Kumaratilake LM,Thompson RCA.A review of the tax onomy and speciation of the genusEchinococcusRudolphi 1801〔J〕.Z Parasitenk,1982,58：121-146.

〔20〕Rausch R.Studies on the helminth fauna of Alaska.XX.The histogenesis of the alveolar larva ofEchinococcusspecies〔J〕.J Inf Dis,1954,94：178-180.

〔21〕Yamaguti S.Sy stema Helminthum Vol.II.The Cestodes of Vertebrates〔M〕.Interscience Publishers,Inc.New Yo rk.1959,441-442.

〔22〕T hompson RCA,Lymbery AJ,Constantine CC.Variation inEchinococcus：towards a taxonomic revision of the genus〔J〕.Adv Parasitol,1995,35：145-176.

〔23〕Thompson RCA.The tax onomy,phylogeny and transmission ofEchinococcus〔J〕.Ex p Parasitol,2008,119：439-446.

〔24〕Xiao N,Qiu JM,Nakao M,et al.Echinococcus shiquicus,a new species from the Qinghai-Tibet plateau region of China：discovery and epidemiological implications〔J〕.Parasitol Int,2006,55(Suppl)：233-236.

〔25〕 Romig T.Epidemiology ofEchinococcosis〔J〕.Langenbecks Arch Surg,2003,388：209-217.

〔26〕Scott JC,Stafaniak J,Pawlowski ZS,et al.Molecular genetic analy sis of human cy stic hydatid cases from Poland：identification of a new genotypic group(G9)ofEchinococcus granulosus〔J〕.Parasitology,1997,114：37-43.

〔27〕Moks E,Jōgisalu I,Valdmann H,et al.First report ofEchinococcus granulosusG8 in Eurasia and a reappraisal of the phylogenetic relationships of‘genotypes'G5-G10〔J〕.Parasitology,2008,135：647-654.

〔28〕Saarma U,Jō gisalu I,M oks E,et al.A novel phylogeny for the genusEchinococcusbased on nuclear data,challenges relationships based on mitochondrial evidence〔J〕.Parasitology,2009,136：317-328.

〔29〕Yamasaki H,Allan JC,Sato MO,et al.DNA differential diagnosis of taeniasis and cysticercosis by multiplex PCR〔J〕.J Clin Microbiol,2004,42(2)：548-553.

〔30〕Yamasaki H,Nakao M,Sako Y,et al.Mitochondrial DNA diagnosis for taeniasis and cy sticercosis〔J〕.Parasitol Int,2006,55(Suppl)：S81-85.

〔31〕Jeon HK,Chaib JY,Kong Y,et al.Differential diagnosis ofTaenia asiaticausing multiplex PCR〔J〕.Exp Parasitol,2009,121(2)：151-156.

〔32〕Yamasaki H,Nakao M,Sako Y,et al.DNA differential diagnosis of human taeniid cestodes by base excision sequence scanning thymine-base reader analysis with mitochondrial genes〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40：3818-3821.

〔33〕Nkouawa A,Sako Y,Nakao M,et al.Loop-mediated isothermal amplification method for differentiation and rapid detection ofTaeniaspecies〔J〕.J Clin Microbiol,2009,47(1)：168-174.