方 強(qiáng),夏 惠,王雪梅,齊文娟,常雪蓮,高 琪

2.江蘇省寄生蟲病防治研究所、衛(wèi)生部寄生蟲病預(yù)防與控制技術(shù)重點實驗室,無錫 214064

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病,目前全球40%的人口生活在瘧疾流行區(qū),有109個國家的約33億人口受到瘧疾感染的威脅,約2.47億人罹患瘧疾,死亡人數(shù)達(dá)88.1萬〔1〕。間日瘧原蟲是對人類危害僅次于惡性瘧原蟲,據(jù)估計全球受到間日瘧原蟲感染威脅的人口高達(dá)26億〔2〕,而每年約有0.8-3億人因間日瘧原蟲感染而出現(xiàn)急性發(fā)作〔3-5〕。在我國,估計目前每年有70萬左右瘧疾患者,主要是間日瘧患者,但在部分地區(qū)有間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲的混合流行〔6-7〕。瘧疾的診斷是瘧疾防治工作中的一個重要環(huán)節(jié),當(dāng)前瘧疾的發(fā)病率和死亡率難以控制的一個重要原因就是在瘧疾流行區(qū)缺乏有效的診斷和治療手段。依據(jù)全球瘧疾控制方案的規(guī)定,WHO全球方案執(zhí)行研究組特別強(qiáng)調(diào)早期診斷和正規(guī)治療的重要性〔8〕。鑒于病原檢測方法及PCR方法在瘧疾診斷中均存在一定的局限性,免疫快速診斷方法近年來在瘧疾防治研究領(lǐng)域得到了高度重視。

瘧原蟲乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途徑的末端酶,在整個紅內(nèi)期均存在,是瘧原蟲生長所必須的酶。由于其具有不同于人類紅細(xì)胞 LDH的獨特理化和免疫化學(xué)性質(zhì),故在瘧疾診斷和新藥篩選方面具有重要的應(yīng)用價值。目前國內(nèi)外對于惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶已經(jīng)有較多的研究,已有以其為診斷靶抗原的診斷試劑投入現(xiàn)場使用,而對于間日瘧原蟲乳酸脫氫酶的研究卻較為滯后。直到2004年Brown WM與Turgut-Balik D先后報道了Salvador I株LDH的部分基因序列和Belem株的LDH 全基因序列〔9-10〕,國內(nèi)亦于06年報道了云南的PvLDH 的部分序列〔11〕。但中國PvLDH編碼區(qū)全長基因序列卻一直未見報道。我國的瘧疾流行以間日瘧為主,克隆可望作為診斷靶抗原的PvLDH編碼區(qū)全長基因?qū)τ诮⑿碌寞懠部焖倜庖咴\斷方法,進(jìn)行瘧疾防治防治有著重要的意義。為此,我們采用基因克隆技術(shù),擴(kuò)增了來自中國安徽間日瘧原蟲LDH編碼區(qū)全長基因,將其克隆至pMD18-T載體進(jìn)行序列測定,并利用生物信息學(xué)在線工具對序列進(jìn)行分析并做B細(xì)胞表位預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 間日瘧原蟲 采自安徽省蚌埠市經(jīng)厚薄血片染色鏡檢和PCR檢查確診為單純間日瘧原蟲感染,尚未進(jìn)行藥物治療,年齡≥18歲,非孕婦且體溫≤39.5℃的間日瘧患者。在告知實驗?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺箪o脈采血5～10mL,肝素抗凝,37℃水浴保溫,2h內(nèi)運(yùn)送至實驗室。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 pMD18-T載體為T aKaRa產(chǎn)品,大腸桿菌DH5α由本室保存。

1.1.3 試劑 TRIzol試劑為 Invitrogen公司產(chǎn)品,cDNA合成試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品(#K1621),PrimeSTARTMHS DNA聚合酶為 TaKa-Ra產(chǎn)品,Tap DNA 聚合酶、dNTP、100bp plus DNA Ladder和 1kb DNA Ladder均為 Fermentas公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 PCR引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中間日瘧原蟲Belem株 LDH基因序列(登錄號：DQ060151)設(shè)計一對引物,上游引物為ATG ACG CCG AAA CCC AAA ATT G,下游引物為：TTA AAT GAG CGC CTT CAT CCT TT T AG,引物由上海英駿公司合成,PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 間日瘧原蟲的濃集和總RNA的提取 將間日瘧患者血樣分離血漿后以不完全1640稀釋為20%紅細(xì)胞懸液,以60%Percoll濃集含蟲紅細(xì)胞,按T rizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,分別用紫外分光光度法測定總 RNA的純度和濃度,1.2%TBE瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量,選取高質(zhì)量的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 總RNA的逆轉(zhuǎn)錄 按照Fermentas公司的RevertAidTM第一鏈 cDNA合成使用說明書操作：其中在20 μ L反應(yīng)體系中,間日瘧原蟲總 RNA量為 3～ 4 μ g,oligo(dT)18為引物 ,M-MuL V 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得間日瘧原蟲cDNA立即進(jìn)行PCR或-20℃保存待用。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以獲得的間日瘧原蟲cDNA為模板,擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 50 μ l。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94℃5 min;然后94℃1 min,56℃1 min,72 C 1 min,30個循環(huán);最后 72℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的TA克隆 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后以膠回收試劑盒回收,加A尾,根據(jù)使用說明書要求與pMD18-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,平鋪入含 Amp 、Xgal、IPTG的LB瓊脂平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.2.5 克隆鑒定及序列測定 分別挑取多個白色單菌落,放入2 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃＞200 r/min 8 h,提取質(zhì)粒DNA。以提取的質(zhì)粒DNA為模板,分別以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆;根據(jù)T載體和目的DNA所含的酶切位點,分別對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行單雙酶切鑒定。將經(jīng)鑒定的陽性克隆菌送上海生工進(jìn)行序列測定。

1.2.6 序列分析 利用NCBI提供的生物信息學(xué)在線工具對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。

1.2.7 B細(xì)胞表位預(yù)測 利用在線工具h(yuǎn)ttp：//tools.immueepitope.org/tools/bcell/iedb_input對推導(dǎo)的PvLDH氨基酸序列進(jìn)行分析,預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、親疏水性、抗原性、蛋白柔韌性,綜合預(yù)測其線性B細(xì)胞表位,并與據(jù)PfLDH氨基酸序列預(yù)測的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行比較分析,預(yù)測PvLDH特異性線性 B細(xì)胞表位;并分析預(yù)測的PvLDH特異性線性B細(xì)胞表位在PvLDH蛋白空間結(jié)構(gòu)的定位。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的質(zhì)量 提取的總RNA A260/A280為1.8-2.0,瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA條帶清晰銳利,無降解彌散,質(zhì)量較好。

2.2間日瘧原蟲LDH編碼區(qū)全長基因的擴(kuò)增 用兩條引物從制備的中國安徽間日瘧原蟲RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴(kuò)增LDH編碼區(qū)全長基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示在約950bp處有一特異性擴(kuò)增條帶,片段大小與預(yù)期結(jié)果(951bp)一致,見圖1。

圖1 間日瘧原蟲LDH PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析M：DNA 標(biāo)準(zhǔn);1：PCR產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR products of PvLDHM：DNA marker;1：PCR products

2.3 LDH編碼區(qū)全長基因重組質(zhì)粒的鑒定 挑選的陽性克隆菌落PCR擴(kuò)增出951bp片段,提取質(zhì)粒做單酶切則見1條約為4 000bp條帶,雙酶切后見2條分別約為3 000bp和1 000bp條帶。表明目的基因已成功克隆入T載體,見圖2。

圖2 pMD18-PvLDH重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定M：DNA標(biāo)準(zhǔn);1：pMD18-PvLDH重組質(zhì)粒 HindⅢ和BamHⅠ雙酶切;2：pMD18-PvLDH 重組質(zhì)粒 HindⅢ單酶切;3：pMD18-PvLDH重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-PvLDH by restriction digestion and PCRM：DNA marker;1：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ and BamHⅠ;2：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ;3：PCR products usingrecombinant plasmid pMD18-PvLDH as template

2.4 序列測定及同源性分析 測定的中國安徽間日瘧原蟲LDH基因的全編碼區(qū)基因長為951bp,無內(nèi)含子,A+T/G+C含構(gòu)成比為509∶442,預(yù)測編碼316個氨基酸,分子量為34kD。該基因已經(jīng)上傳GenBank,收錄號為GU078391。以 BLASTn對獲得的中國安徽PvLDH基因序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果表明我們獲得的中國安徽PvLDH與間日瘧原蟲Sal-I株和Belem株LDH基因比較同源性達(dá)99.9%(950/951),僅在666位處發(fā)生 1個G→C點突變,且其編碼氨基酸無變化,為同義突變。運(yùn)用BLASTp對中國安徽PvLDH基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示安徽PvLDH氨基酸序列與間日瘧原蟲Sal-I株和Belem株LDH同源性為100%,與其它瘧原蟲LDH的同源性分別為：諾氏瘧原蟲LDH預(yù)測序列為97%(307/316)、惡性瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、約氏瘧原蟲均為90%(285/316)、夏氏瘧原蟲為88%(279/316)、三日瘧原蟲LDH已知序列為 90%(272/299)、卵形瘧原蟲LDH已知序列為88%(265/299)。而與艾美球蟲、弓形蟲、巴貝蟲、泰累爾犁漿蟲等其它原蟲的同源性均小于60%。

2.5 線性B細(xì)胞表位分析 利用在線工具分析了推導(dǎo)的PvLDH氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、親疏水性、抗原性、蛋白柔韌性,并據(jù)此預(yù)測其線性B細(xì)胞表位12個線性B細(xì)胞表位見表1、圖3,與據(jù)PfLDH氨基酸序列預(yù)測的線性B細(xì)胞表位,見表2、圖3,分析比較,獲得一間日瘧特異性線性B細(xì)胞表位：KITDEEVE,位于氨基酸序列的 208-215位。通過對預(yù)測表位在PvLDH蛋白空間結(jié)構(gòu)中位置的分析,顯示該預(yù)測表位位于PvLDH表面,見圖4,與PvLDH蛋白(2A92)表面氨基酸匹配率為100%。

3 討 論

瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)同宿主動物L(fēng)DH在理化、免疫學(xué)特性和酶學(xué)方面有很大的差異。在催化乳酸生成丙酮酸反應(yīng)中,pLDH能夠迅速地利用NAD類似物3'-乙酰吡啶NAD(3-acetyl pyridine analog of NAD,APAD)作為輔酶,而紅細(xì)胞LDH(LDHr)在APAD存在時參與這一反應(yīng)速率很慢〔12〕;同時,pLDH 還具有種、屬特異性,而且瘧原蟲的無性期和配子體均可產(chǎn)生該種酶,因而是檢測瘧原蟲理想的靶抗原〔13〕。以惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶作為惡性瘧診斷的標(biāo)靶的快速診斷試劑已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得以廣泛的應(yīng)用,并取得良好的效果〔14-17〕。對于間日瘧原蟲目前尚無特異性快速免疫診斷試劑〔17〕。而我國瘧疾流行則以間日瘧為主,因此,加強(qiáng)間日瘧診斷標(biāo)靶的研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。鑒于我國的間日瘧原蟲的LDH全長基因尚未見報道,我們對克隆了分離自安徽間日瘧流行區(qū)的LDH全長基因,并進(jìn)行了序列分析。

圖3 間日瘧原蟲LDH(a)和惡性瘧原蟲LDH(b)預(yù)測線性B細(xì)胞表位序列。黃色區(qū)域為預(yù)測的表位。Fig.3 B cell linear epitopes prediction of PvLDH(a)and PfLDH(b).The epitopes prediction shown in yellow

表1 間日瘧原蟲LDH和惡性瘧原蟲LDH預(yù)測線性B細(xì)胞表位序列Tab.1 B cell linear epitopes prediction of PvLDH and PfLDH

圖4 預(yù)測的PvLDH特異性線性B細(xì)胞表位在PvLDH四聚體的空間位置黃色區(qū)域為預(yù)測的PvLDH特異性線性B細(xì)胞表位KITDEEVEA、B、C、D四圖為 PvLDH 四聚體逆時針旋轉(zhuǎn),旋轉(zhuǎn)90°Fig.4 Space location in PvLDH tetramer of the specific B cell linear epitopes prediction of PvLDH The specific B cell linear epitopes predicted of PvLDH show in yellowA,B,C,D show go degree counterclockwise rotations of PvLDH tetramen

本研究顯示克隆的中國間日瘧原蟲安徽株LDH的基因序列與Belem株和Salvador Ι株的基因序列有高度的同源性,核苷酸序列僅有一處點突變,且為同義突變,其編碼氨基酸序列的無改變。同已經(jīng)登陸于GenBank的其它間日瘧原蟲蟲株(如Belem株和Salvador Ι株)的LDH氨基酸序列一致的現(xiàn)象結(jié)合分析,表明不同蟲株間日瘧LDH具有高度的同源性。這種不同蟲株間的間日瘧LDH高度同源性更顯示了其作為瘧疾免疫快速診斷靶抗原的優(yōu)勢。同時,序列分析也顯示在各種不同種的瘧原蟲LDH間也具有高度的保守性,但與艾美球蟲、弓形蟲、巴貝蟲、人類等的LDH相比,則差異很大。利用免疫快速診斷方法進(jìn)行瘧原蟲蟲種鑒別診斷的關(guān)鍵是獲得種特異性LDH單克隆抗體,而由于瘧原蟲LDH具有高度的保守性,以純化的pLDH天然或重組蛋白免疫動物制備單克隆抗體,則獲得瘧原蟲屬共同抗原表位的單克隆抗體的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于獲得間日瘧原蟲種特異性單克隆抗體的幾率,篩選制備種特異性LDH單克隆抗體的難度是可以想象的。近年來,隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,表位預(yù)測手段日趨成熟,所預(yù)測表位的成功率大大提高,利用預(yù)測表位合成肽制備抗體已經(jīng)成為一條可行的路線。因此,我們試圖利用生物信息學(xué)手段來預(yù)測間日瘧原蟲LDH種特異性表位,為制備間日瘧種特異性單克隆抗體做準(zhǔn)備。為此,我們對間日瘧LDH進(jìn)行了線性B細(xì)胞表位預(yù)測,并與PfLDH線性B細(xì)胞表位進(jìn)行對比分析。結(jié)果顯示在2種LDH預(yù)測的潛在表位中大部分存在著共同的氨基酸序列,但值得注意的是間日瘧 LDH氨基酸序列的208-215位KITDEEVE形成的B細(xì)胞表位在PfLDH不存在。因此,這是一個潛在的間日瘧特異性B細(xì)胞表位。然而,目前該潛在的間日瘧特異性B細(xì)胞表位僅是通過序列分析預(yù)測獲得,盡管通過分析其在PvLDH蛋白上空間位置發(fā)現(xiàn)其在PvLDH蛋白表面,為預(yù)測結(jié)果提供了部分佐證,進(jìn)一步增加了其作為B細(xì)胞表位的幾率,但其是否真正具有抗原性,是否確為一個B細(xì)胞表位,還需要通過后續(xù)實驗進(jìn)行驗證。若經(jīng)證實其確為一個間日瘧特異性B細(xì)胞表位,則可以之合成肽免疫小鼠,制備針對該表位的單克隆抗體,建立一種新的檢測間日瘧原蟲的間日瘧特異性診斷方法。

間日瘧原蟲LDH基因的成功克隆和間日瘧特異性B細(xì)胞表位的成功預(yù)測,使我們有可能通過基因工程技術(shù)表達(dá)間日瘧原蟲的LDH蛋白或利用合成肽技術(shù)合成包含間日瘧特異性B細(xì)胞表位的短肽,從而制備間日瘧的種特異性抗體,為實現(xiàn)間日瘧的特異性免疫診斷奠定基礎(chǔ)。

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