單小云,胡 野,應(yīng)延風(fēng),屠平光

2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院人畜共患病研究所,金華 321007

軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的人畜共患病病原體,廣泛存在于天然淡水和人工水域等多種水體環(huán)境中。由軍團(tuán)菌感染引起的軍團(tuán)菌病是一種以肺炎為主要臨床表現(xiàn)的急性細(xì)菌性傳染病,病程進(jìn)展快,死亡率高〔1-2〕。研究表明,軍團(tuán)菌有48種70個血清型〔3〕,但90%以上的軍團(tuán)菌肺炎均由嗜肺軍團(tuán)菌感染引起〔4-5〕。隨著城市化進(jìn)程加快,大型建筑增多,城市人口居住密度增高,軍團(tuán)菌病爆發(fā)和流行的可能性越來越大。因此,對該病進(jìn)行有效的防治已引起社會的普遍關(guān)注。

軍團(tuán)菌病的早期準(zhǔn)確診斷不但有利于該病的治療,而且可有效降低其死亡率。目前,軍團(tuán)菌病的診斷方法主要有血清學(xué)診斷、尿抗原測定、以及通過PCR、qPCR等檢測特定目的基因片段的分子生物學(xué)方法〔6-7〕。雖然從呼吸道分泌物中分離出相應(yīng)的病原體仍被認(rèn)為是診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn),但由于該方法靈敏性低,耗時長,且絕大部分軍團(tuán)菌肺炎患者不分泌痰液,故臨床實驗室實際應(yīng)用價值不大〔7-8〕。又由于軍團(tuán)菌肺炎與其他原因引起的肺炎的臨床表現(xiàn)難以區(qū)別,容易造成誤診。因此,對軍團(tuán)菌病進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的早期診斷具有十分重要的臨床意義。

據(jù)文獻(xiàn)報道,嗜肺軍團(tuán)菌可侵入哺乳動物巨噬細(xì)胞,逃避吞噬體和溶酶體的殺傷作用,并在其中生長繁殖,這與嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制密切相關(guān)〔9-10〕。Edelstein等采用信號標(biāo)記轉(zhuǎn)座子誘變(signaturetagged transposon mutagenesis)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)了1個編碼約28kDa蛋白的軍團(tuán)菌毒力基因(Legionella virulence gene,lvgA),認(rèn)為lvgA蛋白與軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞中的存活緊密相關(guān)〔11-12〕,但其分子致病機(jī)制不明。

本研究試圖通過生物信息學(xué)方法對嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因進(jìn)行分析,同時利用細(xì)胞模型檢測軍團(tuán)菌毒力基因在軍團(tuán)菌感染宿主細(xì)胞后的表達(dá)變化,為闡明該基因的功能和致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并建立基于軍團(tuán)菌lvgA基因檢測軍團(tuán)菌的實時熒光定量RT-PCR,為該病的早期診斷提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料 嗜肺軍團(tuán)菌LP1標(biāo)準(zhǔn)株由浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物所惠贈。大腸桿菌JM 109由本所保存;細(xì)菌RNA/DNA提取試劑盒,cDNA合成試劑盒,PCR系列試劑,T-A克隆試劑盒,質(zhì)粒pMD18-T,限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI,T4DNA連接酶均購自 TaKaRa公司。人單核巨噬樣細(xì)胞THP-1購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2lvgA基因序列及其蛋白結(jié)構(gòu)分析 將嗜肺軍團(tuán)菌Corby株、Lens株和Paris株的lvgA基因序列進(jìn)行比對,并將蛋白序列輸入http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi數(shù)據(jù)庫預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域,采用TMHMM Server v.2.0預(yù)測該蛋白在細(xì)胞膜上的定位情況。

1.3 基因組DNA的提取及l(fā)vgA基因的擴(kuò)增 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)提取嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA。根據(jù)lvgA基因參考序列(Gen-Bank accession No.：NC_009494)的限制性內(nèi)切酶位點分析結(jié)果〔8〕,采用Primer Designer軟件自行設(shè)計PCR引物并由上海Invitrogen公司合成。引物序列：上游5'-GCG CAT ATG (Nde I)GCA GAC GGC GAT ATC-3',下游 5'-GCG CTC GAG(XhoI)TT T TCG TGC AGT AGT TGC-3'。采用PCR試劑盒擴(kuò)增全長lvgA基因片段,反應(yīng)總體積為100 μ L,其中各引物濃度為250 nmol/L,DNA模板 100 ng。PCR 參數(shù)：94℃5 min;94℃30 s、50℃30 s、72℃50 s,30個循環(huán);72℃10 min。采用1.0%溴乙錠預(yù)染瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為624 bp。

1.4 目的基因克隆和測序 采用T-A克隆試劑盒將回收的目的擴(kuò)增片段插入pMD18-T中,再轉(zhuǎn)化至E.coliJM 109中并擴(kuò)增,利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pMD18-T-lvgA。pMD18-T-lvgA經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切初步鑒定后,委托上海invitrogen公司測定插入片段的核苷酸序列,然后與lvgA基因參考序列(GenBank accession No.：NC_009494)進(jìn)行比對。

1.5 宿主細(xì)胞中軍團(tuán)菌總RNA的提取以及cDNA的合成 按100∶1的比例用軍團(tuán)菌感染THP-1細(xì)胞,在37℃條件下孵育1、2、4、8h后去除上清液,用PBS將細(xì)胞洗滌三次。采用細(xì)菌RNA提取試劑盒(MiniBEST RNA Extraction Kit)提取不同樣本中的總RNA。將總RNA用DNase處理后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)合成cDNA,并以此為熒光定量PCR的模板。正常條件下培養(yǎng)的嗜肺軍團(tuán)菌被用作對照。

1.6 實時熒光定量RT-PCR 根據(jù)本研究中所檢測的嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因序列及GenBank中嗜肺軍團(tuán)菌16S rDNA基因序列(Accession No.：NC_006368),采用Primer Express軟件,設(shè)計用于熒光定量PCR擴(kuò)增lvgA基因片段以及作為內(nèi)參的16S rDNA基因片段的引物。用于擴(kuò)增lvgA基因片段以及16S rDNA基因片段的引物分別為：5'-TCATAGAACCCGAACTGATACCTGG-3',5'-GCACATAGACATGCCTGCACTAAAC-3',和5'-GAAGAACCT TACCTACCCT TGACATACAG-3',5'-TCGT TACGGGACT TAACCCAACATC-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為 125bp、133bp。采用TaKaRa公司 SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒對不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣本進(jìn)行檢測。反應(yīng)體積為 50 μ L,內(nèi)含 1×SYBR Premix Ex-TaqTMII、10 μ mol/L 各引物、1 ×ROX Reference Dye II、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μ L。利用ABI7500 Realtime PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增 ,反應(yīng)參數(shù) ：95℃10 s、95℃5 s、60℃34 s,40個循環(huán)。之后采用△△CT數(shù)學(xué)模式對實時熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。同時采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因轉(zhuǎn)錄水平相對值進(jìn)行t檢驗等統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 臨床樣本中l(wèi)vgA基因的檢測 檢測樣本來自金華市中心醫(yī)院的30份肺炎患者血液,其中10份經(jīng)病原學(xué)檢測為嗜肺軍團(tuán)菌陽性。實時熒光定量RT-PCR檢測的擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體系為50μ L,包括 SYBR Premix EX Taq II(2×)25μ L、上游引物(10μ mol/L)2.0μ L 、下游引物(10μ mol/L)2.0μ L 、ROX Reference Dye II(50 ×)1μ L、模板 DNA 4μ L,用ddH2O補(bǔ)足至50μ L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10s后,采用二步法進(jìn)行反應(yīng)：95℃5 s、60℃30s,40個循環(huán)。在60℃設(shè)定熒光檢測點。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù),反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果,ct值＜35,且反應(yīng)曲線良好判為陽性〔13〕。

2 結(jié) 果

2.1 嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因的PCR擴(kuò)增 采用如上所述的特異性引物對所提嗜肺軍團(tuán)菌LP1基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,擴(kuò)增得到一條產(chǎn)物大小的lvgA基因片段條帶。通過TA克隆,成功構(gòu)建了pMD18-T-lvgA質(zhì)粒,結(jié)果見圖1。

2.2 嗜肺軍團(tuán)菌不同菌株lvgA基因核苷酸序列及其氨基酸序列分析 通過TA克隆、測序,將嗜肺軍團(tuán)菌LP1基因組DNA中的lvgA基因序列與已報道的其他菌株中的lvgA基因序列(GenBank No.：NC_006369、NC_009494、NC_006368)進(jìn)行比較分析,與嗜肺軍團(tuán)菌LP1lvgA基因核苷酸和氨基酸的相似性分別為：99%,96%,96%和99%,98%,98%,見圖2,3。

圖1 嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA中擴(kuò)增的lvgA基因目以及質(zhì)粒pMD18-T-lvgA的酶切鑒定M：marker(TaKaRa);1：嗜肺軍團(tuán)菌 lvgA基因擴(kuò)增條帶;2：雙酶切鑒定質(zhì)粒 pMD18-T-lvgA。Fig.1 The amplification result of lvgA gene from DNA of L.pneumophila and identification of plasmid pMD18-T-lvgA by restriction enzyme digestionM：mark(TaKaRa);1：Amplification result of lvgA gene from L.pneumophila;2：Identification of plasmid pMD18-T-lvgA by double enzyme digestion.

2.3lvgA基因中保守功能結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 通過Blast比對發(fā)現(xiàn),雖然嗜肺軍團(tuán)菌 LP1中的lvgA基因為毒力相關(guān)基因,但在其氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)存在某種保守功能結(jié)構(gòu)域。通過跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)LvgA蛋白為1種定位于外膜并部分表面表達(dá)的單體結(jié)構(gòu)。

2.4lvgA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 本研究采用實時熒光定量RT-PCR檢測嗜肺軍團(tuán)菌LP1在37℃條件下感染 T HP-1細(xì)胞2、4、6、8h后,其lvgA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。結(jié)果表明,嗜肺軍團(tuán)菌LP1感染THP-1細(xì)胞2h后,lvgA基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)明顯,比正常培養(yǎng)條件下嗜肺軍團(tuán)菌LP1的lvgA基因轉(zhuǎn)錄水平最大上調(diào)4.3倍。提示lvgA基因可能與嗜肺軍團(tuán)菌 LP1在巨噬細(xì)胞中的存活有關(guān),見圖4。

2.5 臨床樣本中l(wèi)vgA基因的檢測結(jié)果 經(jīng)基于lvgA基因的熒光定量RT-PCR檢測顯示,軍團(tuán)菌感染患者的血清檢測結(jié)果均為陽性而其他肺炎患者的血清檢測結(jié)果均為陰性,見圖5。

3 討 論

嗜肺軍團(tuán)菌有15個血清型,其中1型在人軍團(tuán)菌獲得性肺炎中最為常見。嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因為軍團(tuán)菌所特有,對其在宿主體內(nèi)保持完整的毒力必不可少。該基因可能對嗜肺軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞中的增殖、宿主的局部抗菌效應(yīng)以及感染后激發(fā)全身性炎性反應(yīng)等均密切相關(guān)。深入研究lvgA基因?qū)﹃U明嗜肺軍團(tuán)菌的毒力及致病機(jī)制具有重要意義〔14-15〕。

圖2 4株嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因核苷酸序列比較1-3：嗜肺軍團(tuán)菌 Lens株,Corby株,Paris株 lvgA基因核苷酸序列,4：嗜肺軍團(tuán)菌1型菌株 lvgA基因核苷酸序列。Fig.2 Comparison sequences of lvgA genes from four L.pneumophila strains1-3：lvgA gene sequences form L.pneumophila strain Lens,Corby,Paris.4：lvgA gene sequence form L.pneumophila type I.

本研究采用TA克隆技術(shù)構(gòu)建了在宿主菌中高拷貝、性質(zhì)穩(wěn)定的pMD18-T-lvgA。通過基因測序、生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌1型中的lvgA基因與嗜肺軍團(tuán)菌Corby株、Lens株和Paris株中的lvgA基因序列極其相似,核苷酸和氨基酸序列的相似度分別為99%,96%,96%和99%,98%,98%,說明lvgA基因保守地存在于嗜肺軍團(tuán)菌中。從氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)某些核苷酸的突變并未引起相對應(yīng)氨基酸的改變,也進(jìn)一步說明了lvgA基因表達(dá)產(chǎn)物序列、功能的保守性。通過膜定位分析預(yù)測并發(fā)現(xiàn)lvgA基因表達(dá)產(chǎn)物是1種定位于外膜的單體結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示lvgA基因可以作為研制軍團(tuán)菌病疫苗的候選基因。

為了闡明嗜肺軍團(tuán)菌lvgA基因的潛在功能,分析嗜肺軍團(tuán)菌在不同條件下lvgA基因的表達(dá)變化是首要問題。據(jù)文獻(xiàn)報道,嗜肺軍團(tuán)菌可侵入哺乳動物巨噬細(xì)胞,逃避吞噬體和溶酶體的殺傷作用,并在其中生長繁殖。本研究采用實時熒光定量RTPCR檢測嗜肺軍團(tuán)菌在體外感染巨噬細(xì)胞后lvgA基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況。結(jié)果顯示該基因轉(zhuǎn)錄水平最大上調(diào)達(dá)4.3倍,表明嗜肺軍團(tuán)菌毒力基因lvgA表達(dá)產(chǎn)物確實與該菌在巨噬細(xì)胞中的存活和增殖有關(guān)。

目前實驗室診斷嗜肺軍團(tuán)菌病的常用手段主要有細(xì)菌培養(yǎng)、直接熒光抗體染色、尿軍團(tuán)菌抗原測定和PCR試驗等方法,但均存在不足之處。對軍團(tuán)菌病進(jìn)行早期準(zhǔn)確診斷需要有更敏感、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測方法。本研究表明嗜肺軍團(tuán)菌在感染巨噬細(xì)胞的過程中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)明顯,而且lvgA基因在各個菌株中保守存在,提示建立基于lvgA基因的熒光定量RT-PCR,不但可有效地在軍團(tuán)菌感染早期進(jìn)行檢測,而且可提高檢測的靈敏度。本研究中,以此法檢測肺炎患者的血液樣本,只有嗜肺軍團(tuán)菌肺炎患者血液樣本為陽性。因此表明,如能進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系等手段,我們所建立的基于lvgA基因的熒光定量RT-PCR技術(shù),完全可以用于臨床實驗室進(jìn)行敏感、特異、快速、準(zhǔn)確地檢測血液樣本中的嗜肺軍團(tuán)菌。

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