胡雪明,楊蘭萍,金匯明,許學(xué)斌,冉 陸,闞 飆

2.上海市盧灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心,上海 200025;

3.上海市疾病預(yù)防控制中心,上海 200336;

4.中國疾病預(yù)防控制中心,北京 102206

上世紀(jì)70年代的球磨培養(yǎng)基生產(chǎn)技術(shù)研發(fā)成功為國內(nèi)實驗室提供了與國際接軌的低成本沙門菌分離材料,使之能按照國標(biāo)或行標(biāo)開展沙門菌檢測項目。90年代始,因持續(xù)升溫的食源性疾病研究推動了對沙門菌分離材料和方法的創(chuàng)新,反觀國內(nèi)培養(yǎng)基產(chǎn)品滯后、原材料品質(zhì)下降和腹瀉患者口服抗菌藥物史等多因素影響著實驗室檢測和監(jiān)測沙門菌的敏感性。為提升實驗室在腸道病原菌診斷中的影響力,維護國家參與全球沙門菌監(jiān)測(GSS)中的利益,我們對沙門菌新型與傳統(tǒng)培養(yǎng)基的效果評價基礎(chǔ)上優(yōu)化分離關(guān)鍵點技術(shù),并驗證、評價其可推廣性。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株 敏感性測試菌株包括 26株非傷寒沙門菌和16株傷寒副傷寒沙門菌;特異性測試菌株148株均來自上海市疾病預(yù)防控制中心(CDC)菌種保藏室〔1〕。

1.2 試劑和儀器 亞硒酸煌綠增菌液自行配置〔2〕;羅伯特增菌液(RVS)和木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板(XLD,Oxoid,英國);CHROMagarTM沙門菌顯色瓊脂平板(CAS)(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司);沙門菌分型診斷血清118種(S&A,Ltd,泰國);API-ATB生化鑒定儀(法國生物梅里埃公司);亞硒酸鹽增菌液(SF)、沙門-志賀平板(S.S)、武漢S.S瓊脂平板(WS)、Hektoen平板(HE)、腸道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑(上海市疾病預(yù)防控制中心試劑供應(yīng)中心)。以上試劑避光10℃以下保存,均在有效期內(nèi)使用。

1.3 敏感性與特異性 實驗菌株經(jīng)血平板純化后挑取單個菌落轉(zhuǎn)種富營養(yǎng)肉湯36℃過夜培養(yǎng)后調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?取 10μL 種于 CAS、WS、S.S、HE、XLD 劃線分離,36℃培養(yǎng)24h記錄平板菌落生長：判斷典型陽性菌落CAS為酒紅色圓而濕潤菌落;WS、S.S、HE、XLD皆為中心黑色(硫化氫陽性)的半透明、原色、濕潤菌落;反之陰性。標(biāo)本分離平板若符合典型菌落生長者假設(shè)沙門菌陽性,挑取≤3個菌落接種腸道雙支糖綜合鑒別管36℃培養(yǎng)24h后生化符合(甘露醇+、葡萄糖+、尿酶-、蔗糖-、動力+、靛基質(zhì)-、硫化氫+)者,經(jīng)血清分型結(jié)合生化鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法報告沙門菌血清型。統(tǒng)計敏感性和特異性。

1.4 選擇性增菌液與平板組合使用的敏感性 回顧性在收集不同時期、不同標(biāo)本(預(yù)防性職業(yè)體檢糞便肛拭2 517件、食品增菌標(biāo)本303件、腹瀉病人糞便肛拭870件)直接平板分離、增菌液與平板配伍單盲檢測的敏感性,見表1。2004年本市盧灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心(CDC)實驗室使用單盲法隨機對流行與非流行季節(jié)的各1 000份預(yù)防性體檢糞便標(biāo)本比較SF和SBG分別與WS和CAS配伍檢測的敏感性。

1.5 優(yōu)化方法的驗證 GSS監(jiān)測項目：2005年6-11月上海市CDC使用 SBG-XLD/CAS(優(yōu)化方法1)檢測870份腹瀉病人糞便標(biāo)本的沙門菌月度陽性率為本底依據(jù),制定《上海市沙門菌監(jiān)測(GSS)方案.2006年》〔3〕培訓(xùn)各監(jiān)測點CDC實驗室人員檢測盧灣(后改為黃浦)、長寧、金山、浦東新區(qū)共設(shè)置的12家監(jiān)測點醫(yī)院腸道門診的腹瀉病人糞便標(biāo)本,其中一、二、三級醫(yī)院各4家。優(yōu)化方法1與傳統(tǒng)方法的比較：統(tǒng)計2006和2007年靜安區(qū)預(yù)防性體檢糞便肛拭標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)方法(SF-WS)檢測的沙門菌月度陽性率為基線值,以優(yōu)化方法1替代檢測2008年度靜安區(qū)預(yù)防性體檢肛拭標(biāo)本,比較兩法的月度陽性率。

1.6 優(yōu)化方法在臨床實驗室的室間控制和方法學(xué)評估2008年4月培訓(xùn)GSS監(jiān)測點8家二、三級醫(yī)院的腸道門診和微生物實驗室醫(yī)、技人員,2008年5月始,臨床實驗室使用SBG-XLD(優(yōu)化方法2)和4個區(qū)CDC實驗室使用優(yōu)化方法1各自對腹瀉標(biāo)本進行平行檢測。CDC根據(jù)各醫(yī)院每月菌株符合數(shù)給予質(zhì)量督導(dǎo)和階段性效益評估。

2 結(jié) 果

2.1 平板的敏感性和特異性 42株傷寒和非傷寒沙門菌在CAS、WS 、S.S 、HE、XLD 上的總敏感性分別為 100%、57.1%、61.9%、47.6%、85.7%,3 種以單純糖-指示劑為原理的平板(WS、S.S、HE)的假陰性絕大多數(shù)為傷寒、副傷寒沙門菌和部分非傷寒沙門菌,XLD上的假陰性則以傷寒、副傷寒沙門菌為主;148株非沙門菌在 CAS、WS、S.S、HE 、XLD上的總特異性分別為 96.6%、93.2%、93.92%、93.2%、92.6%。CAS上的假陽性有2株大腸埃希菌、1株溶血不動桿菌、1株銅綠假單胞菌、1株近平滑假絲酵母菌,培養(yǎng)時間延長至48h后假陽性菌落或挑之有粗糙感或在色度和濕潤度上均有別于典型菌落。其余平板的假陽性菌落多由產(chǎn)硫化氫的7株枸櫞酸桿菌和少數(shù)腸桿菌(1株遲緩愛德華腸桿菌、1株雷氏普魯菲登腸桿菌、1株奇異變形桿菌、1株蜂房哈夫尼亞腸桿菌)及1株溶血不動桿菌產(chǎn)生〔1〕。

2.2 增菌液和平板配伍檢測的敏感性 不同時期多基于糞便標(biāo)本為主的不同增菌液之間和一種增菌液與不同平板單盲法檢測沙門菌的敏感性顯示CAS和 XLD優(yōu)于 WS、S.S、HE;但臨床肛拭標(biāo)本用CAS直接檢測的敏感性也僅為23.0%,說明對肛拭為主的糞便標(biāo)本增加選擇性增菌是必要步驟;而傳統(tǒng)增菌液與平板配伍：SF-S.S的敏感性為0和35.9%,更換了SBG增菌液后用類似的WS平板檢測敏感性也可達(dá)到71.8%,而臨床肛拭標(biāo)本用SBG增菌后用 CAS、XLD合并檢測的總敏感性為100%,其中CAS以94.4%的敏感性優(yōu)于XLD的89.7%。增菌后的平板分離效果顯示,SBG效果最佳,RVS次之,國內(nèi)常用的SF較差,見表1。

2.3 方法驗證 2005年6-11月和2006年4月-2009年7月,優(yōu)化方法1檢測腹瀉病人和GSS標(biāo)本數(shù)和月度陽性數(shù)見表2,根據(jù)陽性率作圖1：5年中檢測沙門菌的月度陽性率符合腸道傳染病在流行季節(jié)呈正態(tài)分布的曲線特征,各年的月度陽性率間的波動度相對較小,最高月度陽性率為2008年9月(6.9%),年度陽性率水平呈較低的是2006年,相對陽性率最高為2009年,高峰期保持在8-10月的5%～7%陽性率水平。

優(yōu)化方法1檢測2008年度靜安區(qū)預(yù)防性體檢肛拭標(biāo)本共分離沙門菌129株(0.4%,129/29 687),分別是2006年22株(0.08%,22/29 005)的8倍和2007年12株(0.04%,12/30 577)的10倍。據(jù)3年中沙門菌月度陽性率繪制曲線將2008年與2006、2007年的結(jié)果進行比較,見圖2：在6-10月的流行季節(jié),2008年的月度陽性率是2006、2007年的2～10倍;其他非流行季節(jié),2008年也均明顯高于2006和2007年同期的月度陽性率。

表1 5種沙門菌選擇性平板在菌株及3種增菌液配伍檢測的敏感性(%)〔1,4〕Tab.1 The susceptibility test by stock of strainsand combiningthree Salmonella selective enrichment broth on five selective medium

表2 2005-2009年月度檢測腹瀉標(biāo)本數(shù)和沙門菌陽性數(shù)Tab.2 The nember of diarrheic specimen and isolates Salmonella in mouthly surveillance(2005-2009)

2.4 優(yōu)化方法的室間控制 比較2008年5月-2009年8月上海市8家二、三級醫(yī)院實驗室用優(yōu)化方法2和區(qū)CDC實驗室使用優(yōu)化方法1平行檢測GSS標(biāo)本的月度陽性菌株數(shù),區(qū)CDC實驗室檢菌數(shù)為197高于臨床實驗室的155(假設(shè)CDC檢測敏感性為100%則醫(yī)院的敏感性為78.7%)。通過市、區(qū)CDC加強兩級督導(dǎo)尋找產(chǎn)生誤差原因、糾正認(rèn)為因素和臨床實驗室對檢測流程的熟練度逐漸增加等原因,使2009年兩者的平行檢測差距同比小于2008年同期,見圖3。2009年8月高峰期出現(xiàn)的較大差異現(xiàn)象經(jīng)調(diào)查為黃浦區(qū)中心醫(yī)院腸道門診人員更替造成的偏倚。在8家二、三級醫(yī)院中以上海市第九人民醫(yī)院的40株和黃浦區(qū)CDC的45株的檢測符合率最高,敏感性達(dá)到88.9%,高于其他臨床醫(yī)院實驗室結(jié)果,見圖 4。優(yōu)化方法 2因未使用CAS其成本僅為方法1的1/3,8家臨床醫(yī)院使用優(yōu)化方法2歷經(jīng)2年檢測的總敏感性為78.7%,其中第九人民醫(yī)院最高88.9%的敏感性與前期2005年89.7%的結(jié)果接近。

3 討 論

2008年通過國家大疫情網(wǎng)絡(luò)直報的感染性腹瀉(丙類傳染病)人數(shù)較歷史同期水平出現(xiàn)大幅增長,但自臨床實驗室診斷并報告為沙門菌的(多數(shù)沒有分型)全國僅有280余例(其中包括上海市金山區(qū)1例食源性暴發(fā)的90多例)。通過2005-2009年的GSS監(jiān)測數(shù)據(jù)證明,沙門菌在本市腸道病流行季節(jié)可達(dá)到5%～7%的臨床分離率,說明國內(nèi)多數(shù)臨床醫(yī)院腸道門診可能存在采樣率不足和實驗室檢測敏感性嚴(yán)重偏低的問題,也為臨床實驗室改革沙門菌檢測現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)提供了客觀數(shù)據(jù)〔5〕。

影響沙門菌常規(guī)檢測的因素有很多,本次的平板敏感性測試證實不同非傷寒沙門菌株間產(chǎn)硫化氫表型有很大差異,故可解釋S.S在菌株測試和標(biāo)本分離敏感性低的問題,緣于標(biāo)本中大量產(chǎn)硫化氫的腸肝菌干擾嚴(yán)重降低平板篩檢的陽性預(yù)測值、增加無效鑒定的人工和花費。CAS作為第三代沙門菌顯色平板因含有雙酶底物能明顯克服產(chǎn)硫化氫等非沙門菌的干擾,提高平板篩檢的準(zhǔn)確性、減少工作量。除在體檢標(biāo)本分離到傷寒沙門菌外,還能避免少數(shù)硫化氫陰性的變異沙門菌引起暴發(fā)病例的漏檢,唯一的缺點是價格較昂貴〔1,7〕。

選擇性增菌液中的靶菌濃度低于106cfuml可能無法用平板分離到。SF因不可高壓、需避光保存和最佳增菌時間為8～12h等苛刻條件使其受國外用戶的限制;RVS現(xiàn)多用于食品沙門菌增菌;SBG配方中增加了修復(fù)損傷沙門菌的能力,RVS和SBG的最佳增菌時間皆為18～22h,即培養(yǎng)過夜后菌量基本都能達(dá)到最大值(109cfuml)易被平板篩檢〔8〕。另外,由于SBG中添加的磺胺類藥能提高抑制雜菌的能力也間接提高平板分離靶菌的敏感性。數(shù)據(jù)表明,使用SBG增菌后即使用WS平板分離的敏感性也可達(dá)到71.8%,說明增菌液的優(yōu)化配伍可以提高傳統(tǒng)平板分離的敏感性,間接降低檢測成本。

沙門菌選擇性增菌液和平板分別是影響分離敏感性的主次因素,兩者互為因果且互為影響,在確認(rèn)能夠滿足有效增菌的前提下進行平板分離是沙門菌分離技術(shù)的關(guān)鍵點。為國內(nèi)高端的專業(yè)實驗室提供滿足不同能級沙門菌檢測需要。

包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)方法在內(nèi)的諸多“快診”方法已被應(yīng)用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的實驗室應(yīng)對,但源于食品加工者導(dǎo)致食源性暴發(fā)和潛在的、多點散發(fā)的沙門暴發(fā)病例的防控仍需高度依賴眾多公共衛(wèi)生和臨床實驗室基于操作簡單、敏感、高效的常規(guī)方法所建立的常態(tài)監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)〔3,9〕。

(對參與項目的上海市第九人民醫(yī)院孫康德;黃浦區(qū)中心醫(yī)院周耀忠;東方醫(yī)院李永明;仁濟醫(yī)院浦東分院汪雅萍;金山醫(yī)院吳麗桂;金山區(qū)中心醫(yī)院沈秀珍;長寧區(qū)中心醫(yī)院徐偉紅;同仁醫(yī)院徐斌等微生物檢驗同仁在此一并致謝!)

〔1〕許學(xué)斌,顧寶柯,楊蘭萍,等.5種沙門菌分離培養(yǎng)基的應(yīng)用和比較〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15：773-775.

〔2〕Parks LC.Handbook of microbiological media〔M〕.2th.CRC Press,Inc,2000：Boca Raton,Fla.1476.

〔3〕朱超,許學(xué)斌.沙門菌血清型診斷〔M〕.上海：同濟大學(xué)出版社,2009：368-394.

〔4〕許學(xué)斌,顧寶柯,陳敏,等.沙門菌檢測方法的優(yōu)化〔J〕.檢驗醫(yī)學(xué),2007,22：677-680.

〔5〕顧寶柯,袁政安,金匯明,等.上海市沙門菌病流行特征分析〔J〕.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2008,253：245-247.

〔6〕衛(wèi)生部.細(xì)菌性和阿米巴痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS287-2008).

〔7〕許學(xué)斌,袁政安,金匯明,等.上海市山夫登堡沙門菌流行特征和分子分型研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2009,30：933-937.

〔8〕Feder I,Nietfeld JC,Kelly B.Evaluation of enrichment techniques for the isolation ofSalmonellacholeraesuis from swine feces〔J〕.J Microb Methods,1998,33：143-151.

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