何 濤,淳 澤,汪天杰,鄭若劫

(中國科學院成都生物研究所,四川成都 610041)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale Kimura et Migo)既是傳統(tǒng)名貴中藥,又是國家保護植物。為了做到保護與開發(fā)并舉,通常利用組織培養(yǎng)的方法快速繁殖獲得種苗,為人工栽培提供種源。在前人對鐵皮石斛快速繁殖的報道中,多集中以種子、莖尖、莖段等為外植體,并通過原球莖的增殖與分化來繁殖種苗[1-7]。其中存在的問題是用種子繁殖的后代有可能產生變異;莖尖作為外植體會散失母株,莖段由于自身帶菌嚴重,會消毒不徹底。并有研究表明[8]由于石斛的特殊性,在石斛的組織培養(yǎng)中,外植體的選擇是十分關鍵的因素,不同的取材部位和時期,培養(yǎng)的結果也不一樣,并且其他外植體形成的試管苗比種子試管苗成株快,莖粗,苗壯,易成活。而直接取材于腋芽作為外植體,不僅取材更方便,并且不傷母株的莖,能保留莖的完整性。目前對鐵皮石斛腋芽直接培養(yǎng)誘導成苗的研究還未見報道。本試驗擬直接取材于鐵皮石斛的腋芽作為外植體,直接誘導叢芽,比較不同種類、濃度的激素組合和不同的天然提取物對腋芽的存活生長、叢芽的誘導增殖以及成苗的影響,研究和探索叢生芽途徑成苗的數量以及質量,篩選各時期的最佳培養(yǎng)基配方,從而建立叢生芽途徑的高效快速繁殖體系,使通過快速繁殖獲得的植株能與母株保持遺傳上的一致性,為鐵皮石斛野生居群的恢復提供材料,達到保護野生資源的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料鐵皮石斛 (D.officinale)采自貴州荔波、三都,廣西樂業(yè)、永福,種植于本所苗圃。

1.2 方法

當鐵皮石斛植株莖節(jié)間新長出腋芽長 0.5～1.0 cm時,用刀片小心切下完整腋芽,自來水沖洗干凈。在超凈工作臺上,材料先用 75%酒精浸泡30 s后,0.1%升汞消毒 10 min,無菌蒸餾水浸洗 4次,每次 5 min。多余水分用無菌濾紙吸干。最后將材料接種在試驗培養(yǎng)基上。

以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同種類和濃度的NAA、BA以及不同的天然提取物香蕉汁 100 g/L或馬鈴薯 200 g/L,蔗糖 3%,瓊脂 7 g/L,pH 5.8～6.0,高壓滅菌 20～25 min。培養(yǎng)室溫度 (26±2)℃,以日光燈為光源,光照強度 2000 lx,每天光照12 h。

材料接種培養(yǎng)后,隨時觀察腋芽的成活生長、叢生芽的誘導增殖以及試管苗的健壯情況,并定期統(tǒng)計腋芽成活率、叢生芽的誘導增殖倍數和叢芽個數,同時對出瓶試管苗的莖粗、莖高、葉片數、葉色以及根數等形態(tài)學特征進行了調查。

2 結 果

2.1 不同激素組合對腋芽成活生長的影響

基本培養(yǎng)基為 1/2MS,將添加不同種類和濃度的NAA、BA對腋芽的成活生長情況列于表1中。由表1可見,當培養(yǎng)基中沒有添加任何激素時,培養(yǎng)60天后,有 50%的腋芽仍保持成活,但基本維持原來狀態(tài),沒有進一步的生長。而有 50%的腋芽會逐漸變黃褐化而死亡。培養(yǎng)基中添加激素后,腋芽開始伸長生長,并分化出葉。只是激素比例不同,腋芽萌發(fā)生長的時間、存活率有所差異。如果只添加NAA,腋芽成活率只有 33.3%。當 NAA和 BA濃度相同或大于 BA時,腋芽最長 0.5 cm,成活率分別為42.5%和 50%。當 BA濃度大于 NAA時,腋芽萌動時間最早,培養(yǎng) 10天就可見腋芽變粗、伸長,60天后,長度可達 1.5～1.8 cm,長出 3片葉,并且成活率為 100%。以上結果表明,最適合石斛腋芽接種后成活生長的培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA 0.2 mg/L+BA 1 mg/L。

表1 不同激素組合對腋芽成活生長的影響

2.2 不同 BA與香蕉汁組合對叢生芽誘導增殖的作用

在腋芽繼續(xù)伸長生長的同時,其基部不斷有新的叢生芽發(fā)生。表2列出了培養(yǎng)基中添加天然提取物香蕉汁和不同濃度的細胞分裂素BA對叢生芽誘導增殖的影響。由表2可見,加入香蕉汁后發(fā)生叢生芽的時間提前,并能提高芽的增殖倍數,有利于鐵皮石斛叢生芽的誘導與增殖。在生長素 NAA濃度相同 (0.5 mg/L)的情況下,隨著 BA濃度的不斷增加,增殖倍數不斷提高,當 BA濃度為 2.0 mg/L時,培養(yǎng) 160 d,增殖倍數達最大值 14.0,平均增殖倍數也是最高的,為 6.4,1個腋芽能增殖的最多叢芽數高達 111個。但 BA濃度超過 2.0 mg/L,為 5.0 mg/L時,增殖倍數又呈下降趨勢。本試驗表明NAA和 BA適當組合能較大程度的提高增殖倍數,促進叢生芽的誘導與增殖。其最適培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L+香蕉汁 100 g/L。從表2還可以看出,隨著培養(yǎng)時間的延長,增殖倍數也呈逐漸提高趨勢。

表2 不同 BA與香蕉汁組合對叢生芽誘導增殖的作用

2.3 天然提取物對叢生芽生長成苗的影響

叢生芽轉到新的培養(yǎng)基中,經過 2～3個月的壯苗培養(yǎng),形成試管苗。表3表明,當培養(yǎng)基中沒有添加任何天然提取物時,叢生芽長成的試管苗纖細、矮小,葉色淡綠,葉片數少,每苗根數較少。只有13.2%的試管苗達到優(yōu)質苗的標準。當培養(yǎng)基中添加了香蕉汁或馬鈴薯汁時,試管苗的質量得到明顯改善,90%以上的試管苗為優(yōu)質苗。莖高為 6～14 cm,莖粗為 0.2～0.4 cm,葉色濃綠或淡綠,葉片數增加到 5～9片,每株苗根數增多為 5～9條。本試驗表明天然提取物香蕉汁或馬鈴薯汁均有利于壯苗、生根。

表3 天然提取物對叢生芽生長成苗的影響

3 討 論

曾有報道 NAA與 BA適當配合可促進石斛叢生芽的誘導與增殖[9]。本試驗結果也證實了這一點,只是最佳比例組合有所不同,前人報道的最適組合為 NAA 1 mg/L,BA 3 mg/L。我們試驗的鐵皮石斛叢生芽誘導與增殖的最佳比例為NAA 0.5 mg/L,BA 2.0 mg/L,這可能與培養(yǎng)的石斛種類不同有關。另有研究表明[10],在培養(yǎng)基中添加天然提取物椰子汁有利于叢芽的增殖,我們實驗也表明當添加另外的天然提取物香蕉汁也同樣有利于叢芽的增殖。

本試驗還特別對試管苗的根、莖、葉等形態(tài)學特征進行了調查,并與生產中鐵皮石斛種苗的等級進行了比較,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加天然提取物香蕉汁或馬鈴薯汁均能獲得優(yōu)質苗。優(yōu)質苗的獲得為成功移栽奠定了材料基礎。

同時,通過叢生芽途徑建立的快繁體系,也使鐵皮石斛優(yōu)質試管苗的數量得到極大提高,在合適的培養(yǎng)基上,叢生芽誘導的最大增殖倍數可達 14.0。以平均增殖倍數 6.4計算,如果 1個芽 1年繼代培養(yǎng) 5次,可獲得 6.45=10737.4個芽,培養(yǎng) 100個腋芽就可以獲得 100萬個左右的叢生芽,進而可獲得100萬叢試管苗。與分株繁殖相比,大大提高了繁殖系數。

瀕危植物鐵皮石斛高效快繁體系的建立為規(guī)?；a提供了技術上的可能性。其深遠意義不僅僅是規(guī)?；a的種苗依靠人工栽培來滿足市場需求,產生經濟效益,并且規(guī)模繁殖成功還可以增加野生居群數量,有利于野生居群的恢復,產生良好的社會效益和生態(tài)效益。

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