劉志明,王海英,劉姍姍,蔣乃翔,馬大龍

(1.東北林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

芳香植物 (aromatic plants)是含有較多芳香性物質(zhì) (精油或樹脂狀分泌物)的植物,包括全部香料植物、一部分藥用植物、一部分園藝植物 (芳香蔬菜、果樹和一部分觀賞植物)和一些尚沒有被開發(fā)利用的野生植物,是兼有藥用植物和香料植物共有屬性的植物類群。小蓬草[ConyzAcanadensis(L.)Cronq.](syn.Erigeron canadensisL.),菊科 (Compositae)白酒草屬一年生草本,原產(chǎn)于北美洲,現(xiàn)廣泛分布于世界各地。小蓬草具有濃郁芳香氣味,是一種芳香植物,嫩莖葉作飼料,全草或鮮葉入藥,可以提取精油[1-3]。植物精油可以在醫(yī)藥、食品、精細化工等方面具有廣闊應(yīng)用前景。植物精油除了可以作為食用香料和日用香料賦香之外,還具有殺菌、驅(qū)蟲、殺蟲等功效。近年來,有研究表明植物精油還具有除草作用,Tworkoski的研究結(jié)果表明肉桂 (Cinnam om um zeylanicum)精油具有較強的除草活性,而丁香酚 (eugenol)是該精油的主要成分[4]。植物源除草劑是近年來環(huán)境友好型除草劑的研究重點,但形成商品的植物源除草劑還比較少,植物源除草劑的開發(fā)一般以具有化感作用 (allelopathy)的植物為靶標(biāo),研究其具有除草作用的活性成分,直接利用或進行活性成分分子結(jié)構(gòu)修飾、結(jié)構(gòu)改造,開發(fā)新型除草劑。化感作用是植物 (包括微生物)釋放化學(xué)物質(zhì)到外部環(huán)境,影響 (抑制或促進)鄰近植物 (異種個體或同種個體)的生長和發(fā)育。檢測化感物質(zhì)(allelochemicals)對受體植物種子萌發(fā)是化感物質(zhì)活性研究的一種常見方法,化感物質(zhì)對種子萌發(fā)的影響是植物化感作用研究的重要內(nèi)容,也是研究熱點[5-7]。小蓬草夏秋季易形成單種優(yōu)勢群落,影響其他植物生長,可以利用小蓬草的化感作用開發(fā)為環(huán)境友好型除草劑,但這方面的研究報道很少,曹慕嵐等的研究結(jié)果表明小蓬草體內(nèi)抗旱機制多種多樣,能夠適應(yīng)多種生境;小蓬草具有化感作用和生物毒性,其水浸提液對蠶豆根尖細胞有絲分裂產(chǎn)生不同程度的抑制和損傷,具有明顯的遺傳毒性;新鮮小蓬草地上部分和地下部分水浸提液對受體植物水稻和油菜種子最終萌發(fā)及根長具有抑制作用[8-10]。Park等[11]研究了韓國小蓬草的揮發(fā)性組分。Choi等[12]的研究結(jié)果表明韓國小蓬草精油具有細胞毒性。許桂芳等[13]研究了小蓬草新鮮莖葉水浸提液(含有酚類物質(zhì))對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用。高興祥等[14]研究了小蓬草全株干粉乙酸乙酯和乙醇提取物潛在的除草活性。本文研究通過氣相色譜 -質(zhì)譜 (gas chromatography-mass spectrometry)分析秋季小蓬草地上部分水蒸氣蒸餾精油的揮發(fā)性組分,選擇生長迅速、對藥劑反應(yīng)敏感的常用作測定除草劑活性的小粒種子植物試材油菜,借鑒除草活性初步篩選中適合小粒種子發(fā)芽常用的Weiss提出的紙上種子發(fā)芽測定標(biāo)準 (standard seed germination assay on paper)方法 (培養(yǎng)皿法)進行生物測定,尋找新穎除草活性先導(dǎo)化合物,為開發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型除草劑提供仿生合成模板。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供體植物為小蓬草 (ConyzAcanadensis)地上部分,2008年 9月下旬采自黑龍江省哈爾濱市,東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地,并經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林植物資源學(xué)植物標(biāo)本室鑒定。室溫下自然風(fēng)干備用。受體植物的種子為蘇州青油菜種子,購自哈爾濱市種子市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 小蓬草地上部分精油的提取方法

稱取 30 g小蓬草地上部分干樣,剪成 1～2 cm小段,置于 500 mL三頸燒瓶中,水蒸氣蒸餾提取3 h。提取結(jié)束后,提取液每次用 50 mL乙醚萃取,共萃取兩次,合并乙醚層,加入適量無水 Na2SO4干燥 15 min,過濾后置于 40℃水浴下蒸干乙醚溶劑,得到淺黃色油狀精油。再用正己烷 (色譜純)將精油配制成濃度為 0.04 g/mL的溶液,進行氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)分析。

1.2.2 小蓬草地上部分精油的氣相色譜 -質(zhì)譜(GC-MS)分析方法

利用 GC/MS 6890N -5973insert(Agilent,USA),對 0.04 g/mL正己烷精油溶液進行了氣質(zhì)聯(lián)用分析。分析條件如下:DB-17MS毛細管柱,柱長30 m,內(nèi)徑 0.25 mm,膜厚 0.25μm,F ID檢測器;初始溫度 60℃,停留 4 min,升溫速率 20℃/min,160℃停留 6 min后,再以 5℃/min的升溫速率升溫到 220℃,保持 2 min。進樣口溫度 260℃,進樣量 1.0μL,分流比 20∶1,氦氣載氣,流速 1 mL/min;質(zhì)譜連接口溫度:280℃,離子源溫度:230℃,轟擊電壓 70 eV,掃描檢測范圍:15～260 u。

1.2.3 小蓬草地上部分精油的紙上種子發(fā)芽試驗方法

借鑒Weiss提出的紙上種子發(fā)芽測定標(biāo)準和國內(nèi)種子萌發(fā)測定方法[14-15],選取籽粒飽滿、大小均勻的受體植物油菜種子,置于鋪有兩層濾紙的已消毒直徑為 9 cm培養(yǎng)皿內(nèi),每皿各放置 10粒種子,分別加入 1 mL用丙酮 (不溶于水的植物天然產(chǎn)物常用溶劑)配制的 60 mg/mL的小蓬草地上部分精油(對照加 1 mL丙酮)和 9 mL蒸餾水,混合均勻,蓋好培養(yǎng)皿蓋。放在 HPG-280H人工氣候箱內(nèi) (25±1)℃黑暗培養(yǎng),以胚根或胚軸突破種皮 1～2 mm為種子發(fā)芽的標(biāo)準,3次重復(fù),每天觀察記錄發(fā)芽種子的數(shù)量,連續(xù)統(tǒng)計 7天。

配制 100 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分別用丙酮稀釋成 50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法進一步研究不同濃度小蓬草地上部分精油丙酮溶液對受體植物油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

配制 10 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分別用丙酮稀釋成 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法進一步研究不同濃度小蓬草地上部分精油丙酮溶液對受體植物油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

1.2.4 小蓬草地上部分精油的紙上種子發(fā)芽試驗數(shù)據(jù)分析方法

根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計算下列參數(shù)[9,16]:(1)最終發(fā)芽率 (Final Germination,FG)FG=發(fā)芽種子總數(shù) /供試種子總數(shù);(2)化感效應(yīng)敏感指數(shù) (Index of Allelopathic Effect,R I)R I=1-C/T(T≥C),R I=T/C-1(T

試驗數(shù)據(jù)用 SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,對各參數(shù)在不同處理之間的差異進行一維方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小蓬草地上部分精油的氣相色譜 -質(zhì)譜 (GC-MS)結(jié)果與分析

小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分氣相色譜 -質(zhì)譜 (GC-MS)的總離子流色譜圖經(jīng)計算機質(zhì)譜庫自動檢索、解析和部分化合物的人工解析,匹配度 74以上的 10種物質(zhì)被鑒定,通過面積歸一化法計算各化合物的質(zhì)量分數(shù),小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分列于表1。

表1 小蓬草地上部分精油的揮發(fā)性組分

從表1可以看出小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分中,烴類化合物 4種,醇類化合物 4種,酮類化合物 2種,含氮類化合物 1種,匹配度 74以上的 10種物質(zhì)被鑒定,小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分中,檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯、α-姜黃烯、反式 -對 -薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮在波蘭干小蓬草個體發(fā)育不同階段的水蒸餾 (hydrodistillation)5 h全草精油 (herb oil)中被檢測到[17],有研究表明,萜類化合物、酚類化合物、直鏈醇、脂肪族醛和酮等具有化感作用[7,18-20],小蓬草地上部分精油具有開發(fā)為植物源除草劑的潛力。

從表1保留時間 16.323 min的質(zhì)譜人工解析可知,質(zhì)量差規(guī)律的判斷依據(jù):最高質(zhì)量峰與其他碎片離子質(zhì)量差,如出現(xiàn)以下質(zhì)量差,4到 13,19到 25(含氟化合物例外),37,38,50到 53,65,66,則最高質(zhì)量峰不是分子離子峰。另外如差為 14的情況出現(xiàn),應(yīng)考慮是否有同系物出現(xiàn),該質(zhì)譜中質(zhì)量數(shù)最高的峰是 m/z 174(偶數(shù) ),與 m/z 159(奇數(shù) )相差15 u,為失去合理中性物,因此可以認定 m/z 174為分子離子峰。因其余碎片峰 (m/z)都是奇數(shù),可知該分子離子的碎片峰為分子離子單純的斷裂反應(yīng)(脫掉中性自由基),根據(jù)“氮素原則”,凡不含 N原子或含有偶數(shù)個N原子的化合物,分子離子的質(zhì)荷比應(yīng)為偶數(shù) (或相對分子質(zhì)量是偶數(shù))。如果含有偶數(shù)個N原子,質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z 77,51,39等弱的碎片離子峰,表明化合物含有苯基;m/z 89表明苯基上有一個含碳的取代基。相對分子質(zhì)量M=174的分子離子峰,離子失去碎片的情況有:M-43失去的中性碎片為 NHCO,高度分支碳鏈分支處有環(huán)酰胺;M-31失去的中性碎片為 CH2NH2;M-15失去的中性碎片為 CH3,高度分支的碳鏈,在分支處甲基裂解 (側(cè)鏈甲基)[21-24],結(jié)合計算機質(zhì)譜庫自動檢索,初步判定為 2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫-吡唑 -3-酮,但有待于進一步分離、提純、鑒定。

2.2 小蓬草地上部分精油紙上種子發(fā)芽試驗結(jié)果與分析

60 mg/mL的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)的影響,100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5個不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)的影響,10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL 5個不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)的影響測試結(jié)果均列于表2。

表2 小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出,60 mg/mL的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)具有抑制作用,且與對照相比差異極顯著。100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5個不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)均具有抑制作用,且與對照相比差異極顯著。10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和0.625 mg/mL 5個不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)均具有抑制作用,且與對照相比差異極顯著。小蓬草地上部分精油抑制油菜種子發(fā)芽 50%抑制劑濃度 IC50(inhibitor concentration causing 50%inhibition)為0.6 mg/mL。

種子發(fā)芽指數(shù)是從置床開始算起的,發(fā)芽指數(shù)高就說明該種子發(fā)芽所用的時間短,發(fā)芽速度快。從表2可以看出,小蓬草地上部分精油處理的受體植物油菜種子發(fā)芽指數(shù)均低于對照種子發(fā)芽指數(shù),說明小蓬草地上部分精油處理抑制了受體植物油菜種子發(fā)芽速度。

綜合以上分析,可以看出小蓬草地上部分精油主要是通過抑制受體植物油菜種子發(fā)芽速度進而實現(xiàn)抑制其種子萌發(fā),活性組分有檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯等萜類化合物,反式 -對-薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇等醇類化合物,s-香芹酮等酮類化合物,2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫 -吡唑 -3-酮為第一主成分,有望作為除草劑仿生合成模板,需進一步分離、提純、鑒定。

3 結(jié) 論

小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)具有 50%抑制作用的丙酮溶液的適宜濃度 IC50為0.6 mg/mL。小蓬草地上部分精油對受體植物油菜種子萌發(fā)具有抑制作用的活性組分匹配度 74以上的有檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯、反式 -對 -薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮等化合物。2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫 -吡唑 -3-酮為第一主成分,有望作為除草劑仿生合成模板,需進一步分離、提純、鑒定。參考文獻:

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食鹽，很多初學(xué)者對食鹽作為面包配方中的基本原料很是不解。食鹽可以增加面包的風(fēng)味；可以強化面筋，保持面團彈力，加強面團的保氣能力；控制面團發(fā)酵速度，讓面團在發(fā)酵過程中能均勻膨脹。食鹽還可以中和糖的甜味，在含糖量高的面包配方中，可以適當(dāng)增加食鹽的用量。但是過量的食鹽不僅能讓面包很咸，也會抑制酵母的生長繁殖，因此食鹽在面包中的添加量通常為1%～2%（以面粉計）。

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