孫藝 盧宇朱玉華程靜 李建忠冀飛 王榮光袁慧軍

目前常染色體顯性非綜合征型耳聾的致病基因位點(diǎn)已經(jīng)排序到DFNA57[1]，定位了46個(gè)DFNA基因位點(diǎn)。非綜合征型耳聾主要影響高頻，低頻感音神經(jīng)性耳聾(low frequency sensorineural hearing loss,LFSNHL)相對(duì)少見，僅有4個(gè)位點(diǎn)，DFNA1，DFNA6/14/38、DFNA11、DFNA54與LFSNHL有關(guān)。迄今為止，成功克隆致病基因的DFNA位點(diǎn)有21個(gè)，基因23個(gè)，其中與低頻聽力損失相關(guān)的僅有DIAPH、WFS1和MYO7A三個(gè)基因。本課題組收集了一個(gè)常染色體顯性遺傳性聾家系，發(fā)病初期表現(xiàn)為低頻感音神經(jīng)性聾，現(xiàn)將其臨床聽力學(xué)及遺傳學(xué)特征以及應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)DFNA21個(gè)位點(diǎn)23個(gè)基因進(jìn)行初步篩查的結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1家系資料的采集 先證者來自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科門診,此家系命名為BJ-L046家系。2009年4月由專業(yè)研究人員赴患者居住地現(xiàn)場(chǎng)采集臨床資料。調(diào)查中對(duì)尋訪到的28名家系成員進(jìn)行了詳細(xì)問卷式調(diào)查、耳鼻咽喉?？茩z查、全身體格檢查及聽力學(xué)檢查 ,未尋訪到或已故成員情況由親屬補(bǔ)充敘述。調(diào)查問卷內(nèi)容包括:姓名、性別、出生年月、永久居住地址、聯(lián)系電話、耳聾詳細(xì)病史、用藥史、既往史,以排除外傷、爆震、中耳炎、耳毒性藥物等所致聽力下降。該項(xiàng)目的倫理論證由解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)完成,參加者均簽署了知情同意書(18歲以下成員由其父母代簽),并抽取 5～10 ml外周靜脈血用于基因組DNA的提取和后期研究。

1.2檢查方法 對(duì)全部家系成員進(jìn)行純音聽閾檢查[Madsen 502 便攜式聽力計(jì)(丹麥) ,耳機(jī)為EAR - 3A 插入式耳機(jī)(美國(guó))]；聲導(dǎo)抗檢查(Madsen 901，丹麥)；耳聲發(fā)射檢測(cè)(丹麥，Madsen CAPELLA)；聽性腦干反應(yīng)檢測(cè)(Intelligent Hearing Systems SmartEP, America) 。應(yīng)用溫度、前庭誘發(fā)性肌源性電位進(jìn)行前庭功能檢查，對(duì)其中5名患者進(jìn)行了耳聲發(fā)射、聽性腦干反應(yīng)檢查，2名患者進(jìn)行了前庭功能及顳骨CT掃描檢查。

1.3耳聾表型的分析判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照Van Camp等2003年9月倡導(dǎo)的《關(guān)于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學(xué)及聽力學(xué)描述術(shù)語建議案》[2]：①根據(jù)是否伴有全身其他器官系統(tǒng)的異常分為非綜合征型聾、綜合征型聾; ②根據(jù)聽力損失的性質(zhì)分為傳導(dǎo)性聾、感音神經(jīng)性聾及混合性聾;③根據(jù)語言發(fā)育階段分為語前聾、語后聾；④根據(jù)聽力損失的頻率分為：高頻聽力損失型(2～8 kHz 聽力下降為主)、低頻聽力損失型(0. 25～0.5kHz聽力下降為主)、中頻聽力損失型(0. 5～2 kHz聽力下降為主)、全頻聽力損失型(0. 25～8 kHz 聽力下降)；⑤聽力損失程度按照兩耳中聽力較好耳的平均聽閾(0. 5～4 kHz 聽閾的平均值) 來評(píng)估: 20～40 dB HL為輕度聽力損失;41～70dB HL為中度，71～ 95 dB HL為重度; > 95 dB HL為極重度。

1.4選取微衛(wèi)星標(biāo)記(STR Marker)作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行DFNA21個(gè)位點(diǎn)23個(gè)已知耳聾基因篩查

1.4.1微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇 在http://genome.ucsc.edu/網(wǎng)站中查詢DFNA位點(diǎn)中已經(jīng)克隆了的23個(gè)耳聾基因在染色體特定區(qū)域內(nèi)的物理距離，在http://www.marshfieldclinic.org/research/pages/index.aspx網(wǎng)站中查詢并選取與每個(gè)基因物理距離最近的微衛(wèi)星標(biāo)記1～2個(gè)，對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的上游引物的5’端用FAM熒光染料標(biāo)記(上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)。

1.4.2微衛(wèi)星標(biāo)記的分析流程 ①PCR擴(kuò)增體系 5 μl反應(yīng)體積內(nèi)包含10 ng DNA, 每對(duì)引物0.000 25 nmoL, 0.25 U 的 HotStar Taq DNA 聚合酶 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)，3 mmol的Mg2+以及0.32 μmoL dNTP；②PCR擴(kuò)增條件 PCR儀采用 Veriti型 ( Applied Biosystems, USA)。熱循環(huán)條件采用“Touchdown”方式；③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性和上樣 將50 μl的GeneScanTM-400HD ROXTM Size Standard和900ul Hi-DiTM甲酰胺混合配制分子量?jī)?nèi)標(biāo)混合液；每1 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入4 μl分子量?jī)?nèi)標(biāo)混合液，PCR儀95℃變性5分鐘，迅速入冰，加入ABI 3130xl Genetic Analysis測(cè)序儀運(yùn)行Gene Scan毛細(xì)管凝膠電泳；④微衛(wèi)星標(biāo)記分析 應(yīng)用GeneMarker(version 1.65)軟件進(jìn)行微衛(wèi)星等位片段大小分析，同時(shí)進(jìn)行人工檢查校正；分析結(jié)果輸入LINKAGE DESIGNER軟件分析后輸出*.pre、 *.dat、 *.mdf 參數(shù)文件；應(yīng)用LINKAGE(5.1 version)軟件進(jìn)行連鎖分析[3]，計(jì)算LOD值,LOD值≥3提示肯定連鎖，-2

2 結(jié)果

2.1BJ-L046家系的基本資料及家系譜圖 該家系五代居住于北京市,調(diào)查家系成員28人,年齡10～79歲。其中有11人被明確診斷為感音神經(jīng)性聾;耳聾患者癥狀以耳聾、耳鳴為主,未見其他器官系統(tǒng)的異常。家系譜圖見圖1。家系患者Ⅲ：20有氨基糖苷類藥物用藥史，患者Ⅲ:9、Ⅳ:9有環(huán)境噪聲接觸史，BJ-L046家系每代的患病率見表1。通過家系的系譜圖分析可知，BJ-L046家系共5代，各代連續(xù)發(fā)病，每代中男女均可患病，男女發(fā)病比例為9∶5,現(xiàn)存患者分布于第II至第Ⅳ代，系譜圖中最初患者為女性(Ⅰ:2)，其后裔Ⅱ代的子女全部為耳聾患者，患病率達(dá)100%(表1)；第Ⅲ代共10個(gè)子女，其中6個(gè)患病，患病率達(dá)60%，第Ⅳ代共16個(gè)子女，其中4個(gè)患病，患病率為25%，其患病率下降可能由于其中第Ⅳ代成員Ⅳ：7、Ⅳ：12、Ⅳ：13及Ⅳ：17尚未到發(fā)病年齡而將其疾病狀態(tài)定為“不確定”所致；該家系每一代的耳聾發(fā)病年齡相似，在10～20歲(表2)，未見明顯逐代提前或延后的趨勢(shì)。由此可見，BJ-L046家系完全符合典型的常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。

圖1 BJ-L046家系系譜圖

表1 BJ-LO46家系每代的患病率(例)

2.2BJ-L046家系中耳聾患者的聽力學(xué)特征 該家系現(xiàn)存11例患者表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聾，聽力損失程度從輕度到中、極重度不等，輕度為6例，中度3例，極重度2例，聽力損失呈上升型曲線4例，平坦-上升型4例，平坦型3例。聽閾及與年齡的關(guān)系：該家系耳聾表型特征為學(xué)語后的、遲發(fā)的、低頻聽力損失為主的漸進(jìn)性聽力損失。家系中每代患者的平均發(fā)病年齡為10～20歲，11位患者的聽力損失程度與年齡的關(guān)系見表2,可見各代隨著年齡的增加,聽力損失程度逐漸加重,低頻(250～1 kHz)聽力損失可達(dá)重度。

表2 BJ-L046家系現(xiàn)存耳聾患者的聽閾及與年齡的關(guān)系

2.3典型病例 先證者Ⅲ:15，男,39 歲 ,出生后學(xué)語正常 ,28歲時(shí)發(fā)現(xiàn)聽力下降并伴有耳鳴 ,此后病情進(jìn)行性加重 ,無眩暈等伴隨癥狀。純音測(cè)聽顯示呈低頻聽力損失為主的上升型聽力曲線，聽力損失程度為中度(圖2)。ABR測(cè)試結(jié)果示雙側(cè)I-V波間期正常，DPOAE檢查示右耳6.0～8.0 kHz可引出,其余頻率未引出，左耳各頻率均未引出，排除了聽神經(jīng)病。前庭功能檢查雙側(cè)水平半規(guī)管功能正常；前庭誘發(fā)性肌源性電位檢查結(jié)果正常；顳骨CT掃描示內(nèi)耳結(jié)構(gòu)及發(fā)育正常,排除了內(nèi)耳及神經(jīng)的占位病變。

圖2 先證者Ⅲ:15聽力圖

病例Ⅱ：5，男，70歲，為家系患病成員中年齡第二大者，10歲前發(fā)現(xiàn)聽力下降，無耳鳴、眩暈等伴隨癥狀。純音測(cè)聽顯示患者中、高頻受累，表現(xiàn)為平坦型聽力曲線，聽力損失程度為極重度(圖3)。患者Ⅲ：20，35歲，5～6歲出現(xiàn)聽力下降，25歲時(shí)因婦科炎癥有氨基糖苷類藥物用藥史，其聽力圖特點(diǎn)為平坦-上升型；患者Ⅲ：9，53歲，7歲出現(xiàn)聽力下降，30歲左右有環(huán)境噪聲接觸史，其聽力圖特點(diǎn)為平坦型-上升型；患者Ⅳ：9，23歲，18歲出現(xiàn)聽力下降，近2年有環(huán)境噪聲接觸史，其聽力圖特點(diǎn)為平坦-上升型，以上患者氨基糖苷類藥物用藥及接觸噪聲均在發(fā)病之后，聽力圖特點(diǎn)均為低頻聽力損失為主的平坦-上升型曲線，排除了藥物或噪聲所致耳聾的可能性?；颊撷簦?6，17歲，7歲時(shí)曾患急性中耳炎，已治愈，12歲出現(xiàn)聽力下降，檢查雙耳鼓膜完整，聲導(dǎo)抗檢查雙耳鼓室導(dǎo)抗圖為A型，其聽力損失為感音神經(jīng)性耳聾，聽力圖特點(diǎn)為上升型，亦排除了中耳炎所致耳聾的可能性。

圖3 Ⅱ：5聽力圖

2.4DFNA位點(diǎn)23個(gè)耳聾基因篩查結(jié)果見表3。

表3 連鎖分析遺傳標(biāo)記間的兩點(diǎn)LOD值

由表3可見對(duì)DFNA21個(gè)位點(diǎn)23個(gè)基因通過微衛(wèi)星標(biāo)記，數(shù)據(jù)連鎖分析計(jì)算LOD值，無陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，可初步排除DFNA21個(gè)位點(diǎn)中已克隆的23個(gè)基因。

3 討論

DFNA1是第一個(gè)報(bào)道以低頻聽力下降為特征的家系。1981年，Leon[4]首次報(bào)道一個(gè)哥斯達(dá)黎加家系，患者表型特點(diǎn)為10歲左右發(fā)病，低頻聽力下降，進(jìn)展迅速，30歲左右發(fā)展為極重度聾，并累及所有頻率。1992年Leon等[ 5]將該家系的致病基因定位于5q31，并命名為DFNA1。1997年，Lynch等[6]發(fā)現(xiàn)DFNA1家系的致病基因?yàn)镈IAPH1,該基因是果蠅透明基因的同源體，其基因產(chǎn)物在肌動(dòng)蛋白的聚合過程中起重要作用。

DFNA6/14/38[7～10]定位于4p16.3，其致病基因?yàn)閃FS1，該基因可導(dǎo)致Wolfram綜合征，目前認(rèn)為WFS1基因是常染色體顯性遺傳LFSNHL的常見原因，但并不是散發(fā)LFSNHL患者的常見發(fā)病因素[11]。DFNA6/14/38患者的聽力損失特點(diǎn)與DFNA1不同，進(jìn)展緩慢，患者老年時(shí)的聽閾仍能維持在80 dB HL左右，不會(huì)發(fā)展成極重度聾。

DFNA11定位于11q13.5，其致病基因?yàn)镸YO7A，該基因是遺傳性聾的“明星基因”，迄今為止已經(jīng)有90多種MYO7A基因突變可以引起聽力下降，這些突變分布于基因的全長(zhǎng)，大多數(shù)突變能引起Usher綜合征1B和不典型Usher綜合征，部分突變引起非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾(DFNA11)、常染色體隱形遺傳性聾(DFNB2)。1997年Liu[12]等報(bào)道了第一個(gè)DFNA11家系，近10年共報(bào)道了5個(gè)DFNA11家系。在目前已報(bào)道的5個(gè)DFNA11家系中有2個(gè)家系的聽力損失表型特征為低頻感音神經(jīng)性聾，2004年Luijendijk等[13]報(bào)道的荷蘭家系發(fā)病年齡為4～43歲，聽力圖特點(diǎn)為上升型，6例患者中4例出現(xiàn)輕度的前庭功能障礙及隱匿的視覺功能障礙。同年Street等[14]報(bào)道的美國(guó)家系發(fā)病年齡介于20～30歲之間，聽力圖特點(diǎn)為上升型，無前庭功能及視覺功能障礙。

2004年，Gurtler等[15]將一個(gè)瑞士低頻感音神經(jīng)性聾家系的致病基因定位在與DFNA15重疊的區(qū)域，命名為DFNA54，其致病基因目前尚未見報(bào)道。該家系臨床表型特點(diǎn)為發(fā)病年齡5～40歲，進(jìn)展緩慢，聽力損失為輕度到中度，有兩例患者偶有眩暈。

本研究的BJ-L046家系遺傳性聾家系圖譜分析表現(xiàn)為一種常染色體顯性的遺傳方式,為學(xué)語后、遲發(fā)的、漸進(jìn)性、低頻聽力下降為主的表型特征。該家系共5代，各代連續(xù)發(fā)病，每代中男女均可患病，男女發(fā)病比例為9∶5，早期以低頻損失為主，發(fā)病時(shí)即表現(xiàn)為輕、中度聾，至老年時(shí)才發(fā)展至極重度聾，聽力曲線早期呈上升型，逐步發(fā)展呈平坦型。該家系平均發(fā)病年齡各代相似，未見明顯逐代提前或延后的趨勢(shì)。由此可見，BJ-L046家系完全符合典型常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。

目前，遺傳疾病的研究手段包括功能克隆、表型克隆以及定位克隆。針對(duì)本研究報(bào)道的BJ-L046家系，選用了定位克隆的研究方法，應(yīng)用連鎖分析(linkage analysis)方法確定耳聾基因在染色體上的未知位置。家系連鎖分析方法通過假定遺傳模式來決定遺傳標(biāo)記是否與疾病位點(diǎn)連鎖。目前最常用的是Lods法 ,即對(duì)數(shù)優(yōu)勢(shì)計(jì)分法。對(duì)BJ-L046家系的研究策略為首先確認(rèn)該家系是否與已知DFNA位點(diǎn)相連鎖，致病基因是否為已知基因，如果不連鎖，提示可能是新的位點(diǎn)，致病基因可能是新的耳聾基因。本研究選取微衛(wèi)星標(biāo)記(STR Markers)作為遺傳標(biāo)記篩查DFNA位點(diǎn)中已經(jīng)成功克隆致病基因的位點(diǎn)21個(gè)，基因23個(gè)，根據(jù)以上連鎖分析判定方法，無陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，除了與低頻聽力損失相關(guān)的三個(gè)基因DIAPH、WFS1和MYO7A均已被初步排除以外，其它DFNA已知基因也初步被排除。下一步將通過基因芯片技術(shù)對(duì)家系成員進(jìn)行全基因組掃描染色體定位，并進(jìn)一步在定位區(qū)域內(nèi)確定耳聾基因，有望發(fā)現(xiàn)新的與低頻感音神經(jīng)性聾相關(guān)的基因。

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