李麗賢 綜述 林昶 趙立東 楊仕明 審校

最近研究認為，Notch信號途徑調節(jié)的側抑制參與哺乳動物內耳感覺前體細胞定向分化為毛細胞和支持細胞的過程及其嵌合體的形成[1]，在該信號途徑中，使用γ-分泌酶抑制劑后，Notch信號途徑中級聯(lián)反應效應被抑制，其下游轉錄因子Hes1和Hes5的表達減少，間接增加了Math1的表達，因而可能促進內耳毛細胞的發(fā)育。本文就Notch信號途徑參與毛細胞發(fā)育的調控機制作一綜述，以期對耳蝸毛細胞再生機理有更深認識。

1 Notch信號途徑

Notch信號途徑在進化上高度保守，廣泛存在于果蠅、無脊椎動物和脊椎動物中，對細胞的分化、增殖和凋亡及機體的整個生長發(fā)育過程的調控等起著重要的作用[2]。隨著對內耳感覺上皮發(fā)育分子機制研究的深入，目前認為Notch信號途徑相關基因(Hes1和Hes5)在哺乳動物內耳感覺上皮發(fā)育中可能具有重要的作用。

1.1Notch信號途經(jīng)的組成 Notch信號途經(jīng)是由Notch受體、配體(DSL蛋白/哺乳動物是Jagged蛋白)和CSL(一類DNA結合蛋白)等組成。Notch配體N端有一個結合Notch受體所必需的DSL基序。當配體(如Delta)和相鄰細胞的Notch受體結合后，Notch受體被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質區(qū)ICN(intracellular domain of Notch)，進入細胞核與CSL結合，調節(jié)基因表達。CSL為轉錄因子，在哺乳動物中名為CBF1，在果蠅中名為suppressor of hairless，在線蟲中名為Lag-1，簡稱為CSL。CSL能識別并結合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個序列位于Notch誘導基因的啟動子上，ICN不存在時，CSL為轉錄抑制因子，當結合ICN時，CSL能誘導相關基因的表達。Notch信號的靶基因多為堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉錄因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，它們又調節(jié)其它與細胞分化直接相關的基因的轉錄。如哺乳動物中的HES(hairy/ enhancer of split)、果蠅中的E(spl)(enhancer of split)及非洲爪蟾中的XHey-1等。

1.2Notch信號途徑的激活 Notch信號轉導不需第二信使和蛋白激酶的參與，可直接接收鄰近細胞的信號并傳到細胞核，激活相關轉錄因子的表達?，F(xiàn)有研究認為，Notch信號途徑的活化主要采用“三步蛋白質水解模式”，其中涉及到3個蛋白質水解切割位點S1、S2和S3。全長新合成的Notch前體是胞內非活化分子，需被蛋白質水解切割后才具有活性。步驟如下：①分泌運輸中，Notch前體首先被高爾基體內的Furin蛋白酶進行S1位點切割，形成的兩部分通過鈣依賴性非共價鍵結合形成的異二聚體, 成熟的Notch受體被運輸?shù)郊毎砻鎇3]。②配體結合到Notch胞外區(qū)后，ADAM金屬蛋白酶家族的TACE/Kuz在受體的S2位點切割，釋放出胞外部分，留下膜黏連的胞內部分( Notch—intraTM)。③在跨膜區(qū)S3位點被早老素( presenilin，PS) 依賴的γ-分泌酶進行切割釋放可溶的Notch胞內片段( Notch—intra)[4]?？扇艿腘otch-intra被轉移至核內，與Su(H)CBF1(Suppressor of Hairless/C-promoter Binding Factor 1)結合，激活E(sp1)/HES(Enhancer of split/human En — hancer of Split)等靶基因的表達，E(sp1)/HES等表達產(chǎn)物與其相應的分化效應基因的啟動子特異性結合，阻遏相關基因的表達，從而影響毛細胞的分化。參與調控Notch信號途徑的基因均從胚胎早期就開始表達，在胚胎發(fā)育中起重要作用。

1.3Notch信號傳導途徑與內耳感覺上皮的分化 Notch信號途徑在很多不同的物種、不同組織的發(fā)育、細胞的分化過程具有重要的調節(jié)作用。近年來的研究表明，Notch信號傳導途徑與哺乳動物內耳感覺前體細胞定向分化形成毛細胞和支持細胞及嵌合體的調節(jié)有關[1]。

1.3.1哺乳動物內耳感覺上皮的發(fā)育 哺乳動物內耳Corti器主要有兩種細胞，即內、外毛細胞和支持細胞。毛細胞與毛細胞之間各自由支持細胞分隔開來，形成了獨特的嵌合體形式，毛細胞由底回至頂回、內毛細胞至外毛細胞的順序逐漸發(fā)育成熟。目前證實[1]Notch信號通過調節(jié)側抑制(lateral inhibition)，即細胞表面Notch配體與相鄰細胞膜上的受體結合，啟動信號途徑，防止其它細胞發(fā)生同樣的分化，這種調節(jié)在內耳細胞定向分化及嵌合體形成中起關鍵作用。當毛細胞損傷后，Notch信號通路的側抑制可能就削弱了，所以，有關支持細胞能轉分化為毛細胞的學說也許和側抑制的削弱有關，此待進一步研究。在耳蝸發(fā)育過程中Notch配體的表達在math1表達后才開始表達，并在Notch信號途徑的側抑制中發(fā)揮著作用。Notch受體和配體Dll1(Delta-like1)和Jag2(Jagged2)在E14.5就開始在內耳表達。而另一種配體Dll3(Delta-like3)在E15.5聽覺毛細胞發(fā)育階段與Dll1和Jag2共同表達且一直持續(xù)到出生一周后其表達才下調。實驗還發(fā)現(xiàn)，Dll3缺陷的小鼠并不會導致毛細胞數(shù)量的增多[5]，而Notch配體Jag2或Dll1兩者同時缺失時毛細胞數(shù)量出現(xiàn)大量的增多[6]；但當Jag2和Dll1單獨缺失時，毛細胞數(shù)量變化并不大[6,7]，由此推測兩者具有協(xié)同作用。這些實驗結果表明Dll3存在與否并不影響毛細胞數(shù)量的變化，只要Dll1或Jag2其中一者存在就能發(fā)揮Notch介導的側抑制作用，Dll1或Jag2對Dll3具有補償作用。另有實驗證明Notch的另一配體Jag1，其基因的表達或敲除并不影響Notch信號介導的側抑制作用[8]。

1.3.2Notch信號下游效應基因Hes1、Hes5與前神經(jīng)元基因math1對內耳感覺上皮分化的影響 在哺乳動物內耳感覺上皮中，Notch信號相關的靶基因家族主要是含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉錄因子bHLH基序的基因，在哺乳動物內耳感覺上皮的定向分化，特別在毛細胞的形成中起關鍵作用，并參與側抑制的調控及嵌合體的形成，其中主要有Math1、Hes1、Hes5基因。 Math1是一個特定神經(jīng)堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子，同果蠅的前神經(jīng)元基因atonal(ato)具有較高的同源性。1999年Bermingham等[9]首次報道Math1基因在內耳感覺上皮中表達,Math1基因缺陷小鼠胚胎不能產(chǎn)生耳蝸和前庭毛細胞，Math1過表達能使耳蝸的GER(大上皮嵴)細胞及橢圓囊的支持細胞轉化為額外的毛細胞[10]。在耳蝸發(fā)育階段，Math1最早表達于E12.5,而在E14和P0期間是毛細胞開始分化的重要階段，Math1首先表達，而后Hes1、Hes5才表達。Math1基因作為一種促毛細胞基因(pro-hair cell gene)在感覺細胞定向分化及毛細胞的形成中起關鍵作用[11]。Akazawa等[12，13]研究發(fā)現(xiàn)bHLH編碼的math1蛋白中間的E-box相關的轉錄通過bHLH的另一種蛋白E 47，而Hes1和Hes5可以和E47形成沒有功能的異二聚體來抑制E47的轉錄，進一步抑制Math1的作用。在ICR小鼠Jagged2基因突變體(Jag2△DSL)模型中發(fā)現(xiàn)了Hes5基因表達下降，因此，Notch可能通過Jag2激活Hes5基因表達，阻礙分化效應基因Math1的表達[14]。Hes1和Hes5是Notch信號途徑下游效應因子，參與了耳蝸的發(fā)育和調節(jié)毛細胞的分化[15]。在Hesl和Hes5基因突變的小鼠耳蝸中Math1的表達增加，提示Hes基因通過抑制Math1的表達來調節(jié)毛細胞的分化。Math1可以直接與Hes5結合，激活Hes5反過來抑制Math1自身的表達，這是Math1表達負性自身調節(jié)環(huán)路[16]。實驗顯示Hes1過表達阻止Math1誘導的毛細胞分化,因此Hes1通過Math1對毛細胞分化產(chǎn)生負調節(jié)作用,這些結果提示Math1和負調節(jié)因子Hes1之間的平衡對于產(chǎn)生合適的內耳毛細胞數(shù)目非常關鍵[17]。在耳蝸，Hes1基因突變后可引起內毛細胞數(shù)量增加，而Hes5突變可引起外毛細胞數(shù)量增加；在前庭器官，無論是Hes1還是Hes5缺失都會引起橢圓囊或球囊產(chǎn)生額外的毛細胞。這就說明了Hes1和Hes5在調節(jié)哺乳動物內耳毛細胞的分化作用上既獨立又有疊加[15]。

2 γ-分泌酶抑制劑促進內耳毛細胞再生

2.1γ-分泌酶的作用 γ-分泌酶在Notch受體的剪切并釋放可溶的Notch胞內片段中起著關鍵的作用。有研究表明[18]，細胞表面的γ-分泌酶的蛋白水解作用是在細胞膜進行的，可以裂解細胞間的粘附結構并能釋放胞間的信號片段。因此，使用γ-分泌酶抑制劑后可以阻止Notch信號的活化，進一步抑制了Hes1和Hes5的表達，從而以使Math1的表達增加[19]，這對內耳毛細胞的再生和修復可能起到重要的促進作用。

2.2γ-分泌酶抑制劑在體外培養(yǎng)Corti器的研究 近年來的研究表明，在體外培養(yǎng)胚胎期或新生的小鼠[20，21]Corti器中加入γ-分泌酶抑制劑(MDL28170或DAPT)阻斷Notch信號通路后，能夠使耳蝸產(chǎn)生額外的毛細胞。Yamamoto等[21]為了證明 Notch信號通路在耳蝸的作用，分別在體外培養(yǎng)的胚胎時期和新生(P3)的ICR小鼠Corti器里加入γ-分泌酶抑制劑MDL28170三天后，在毛細胞旁邊的區(qū)域即Hensen細胞的位置出現(xiàn)了異位的MyosinVIIa陽性的細胞，且異位的MyosinVIIa陽性的細胞數(shù)比對照組明顯的增多。RT-PCR分析顯示：在MDL28170組Hes1和Hes5表達都有減少，其中Hes5減少明顯，而Math1表達則增加。Takebayashi等[20]用另一種γ-分泌酶抑制劑DAPT對小鼠胚胎的Corti器進行研究，發(fā)現(xiàn)在E14.5時及其以后的胚胎期，DAPT才對Notch信號通路有抑制作用。RT-PCR檢測顯示Hes1和Hes5的表達減少，而Math1的表達增加，并且發(fā)現(xiàn)，毛細胞數(shù)目的增多不是因為毛細胞的增殖引起的，而是通過支持細胞轉分化來的。

2.3γ-分泌酶抑制劑在體的實驗研究 2007年Hori等[22]發(fā)現(xiàn)正常成年豚鼠聽覺上皮幾乎不表達Notch1和Jagged1，而用耳毒性藥物造模后，發(fā)現(xiàn)損傷的聽覺上皮可以表達Notch1和Jagged1。從鼓階用微注泵持續(xù)給MDL28170，2周后可在聽覺上皮出現(xiàn)異位myosinVIIa陽性的細胞，表明γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號后，在成年哺乳動物聽覺上皮出現(xiàn)了異位的毛細胞，說明使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路對損傷的聽覺上皮的毛細胞再生可能有促進作用。Notch1、Jagged1的表達和異位毛細胞的免疫表型主要在聽覺上皮的內溝區(qū)，而胚胎和新生哺乳動物的聽覺上皮的大上皮嵴區(qū)和成熟動物的聽覺上皮內溝區(qū)域相對應[23]。

然而，體外培養(yǎng)和在體實驗中發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路后，也會造成不良的副作用。Daudet等[24]研究發(fā)現(xiàn)在雞胚的HH16-17時期就開始持續(xù)用DAPT抑制Notch信號，可能會導致聽覺斑的數(shù)量、大小及毛細胞的減少。但是，相對于用病毒等載體攜帶Math1基因促進毛細胞再生的研究來說，γ-分泌酸抑制劑可不用考慮病毒的毒性，有利于臨床的推廣應用。所以，對于γ-分泌酶抑制劑，還需對其進行更充分的實驗研究，以便能應用于內耳毛細胞再生的研究中。

3 參考文獻

1 Zine A, Water TRVD, Ribaupierre F. Notch signaling regulates the pattern of auditory hair cell differentiation in mammals[J]. Development,2000,127:3 373.

2 Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development[J]. Science,1999,284:770.

3 Rand MD, Grimm LM, Artavanis-Tsakonas S, et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors[J]. Mol Cell Biol, 2000,20:1 825.

4 Struhl G, Greenwald I. Presenilin-mediated transmembrane cleavage is required for Notch signal transduction in Drosophila[J].PNAS, 2001,98:229.

5 Hartman BH, Hayashi T, Nelson BR,et al.Dll3 is expressed in developing hair cells in the mammalian cochlea[J]. Deve-lopmental Dynamics,2007, 236:2 875.

6 Kiernan AE, Cordes R, Kopan R, et al. The Notch ligands Dll1 and Jag2 act synergistically to regulate hair cell development in the mammalian inner ear[J]. Development,2005,132:4 353.

7 Brooker R, Hozumi K, Lewis J. Notch ligands with contrasting functions: Jagged1 and Delta1 in the mouse inner ear[J]. Development,2006,133:1 277.

8 Kiernan AE, Xu J, Gridley T. The Notch ligand Jag1 is required for sensory progenitor development in the mammalian inner ear[J]. PLoS Genet, 2006, 2: 27.

9 Bermingham NA, Hassan BA, Price SD, et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells[J]. Science,1999,284:1 837.

10 Zheng JL, Gao WQ. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears[J]. Nat Neurosci,2000,3:580.

11 Woods C, Montcouquiol M, Kelley MW. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea[J]. Nat Neurosci,2004,7:1 310.

12 Akazawa C, Sasai Y, Nakanishi S, et al. Molecular characterization of a rat negative regulator with a basic helix-loop-helix structure predominantly expressed in the developing nervous system[J]. J Biol Chem,1992,267:21 879.

13 Akazawa C, Ishibashi M, Shimizu C, et al. A mammalian helix-loop-helix factor structurally related to the product of drosophila proneural gene atonal is a positive transcriptio-nal regulator expressed in the deve-loping nervous system[J]. J Biol Chem,1995,270:8 730.

14 Lanford PJ, Shailam R, Norton CR, et al. Expression of math1 and hes5 in the cochleae of wildtype and Jag2 mutant mice[J]. J Assoc Res Otolaryngol,2000,1:161.

15 Zine A, Aubert A, Qiu J, et al. Hes1 and hes5 activities are required for the normal development of the hair cells in the mammalian inner ear[J]. The Journal of Neuroscience,2001,21:4 712.

16 Helms AW, Abney AL, Ben-Arie N, et al. Autoregulation and multiple enhancers control math1 expression in the developing nervous system[J]. Development,2000,127:1 185.

17 Zheng JL, Shou J, Guillemot F, et al. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation[J]. Development, 2000,127:4 551.

18 Chyung JH,Raper DM,Selkoe DJ. γ-Secretase exists on the plasma membrane as an intact complex that accepts substrates and effects intramembrane cleavage[J]. The Journal of Biological Chemistry,2005,280:4 383.

19 Mizutani T, Taniguchi Y, Aoki T, et al. Conservation of the biochemical mechanisms of signal transduction among mammalian Notch family members[J]. PNAS,2001,98：9 026.

20 Takebayashi S, Yamamoto N, Yabe D, et al. Multiple roles of Notch signaling in cochlear development[J]. Dev Biol,2007,307:165.

21 Yamamoto N,Tanigaki K,Tsuji M,et al.Inhibition of Notch/RBP-J signaling induces hair cell formation in neonate mouse cochleas[J]. J Mol Med,2006,84:37.

22 Hori R, Nakagawa T, Sakamoto T, et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling in the mature guinea pig cochlea[J]. Neuroreport,2007,18:1 911.

23 Pirvola U, Ylikoski J, Trokovic R,et al. FGFR1 is required for the development of the auditory sensory epithelium[J]. Neuron,2002,35:671.

24 Daudet N, Ariza-McNaughton1 L, Lewis J. Notch signalling is needed to maintain, but not to initiate, the formation of prosensory patches in the chick inner ear[J]. Development, 2007,134:2 369.