郜元坤 華清泉 廖華 李孟

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth-associated protein，GAP-43)是與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關(guān)的一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白，是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)錐膜面富含的特異性酸性磷蛋白，是生長(zhǎng)錐膜的主要組成部分，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用。生長(zhǎng)錐膜上GAP-43表達(dá)量與軸突生長(zhǎng)相一致，可反映軸突生長(zhǎng)及突觸形成所處的大致?tīng)顟B(tài)。GAP-43與神經(jīng)損傷后突觸的再生及重組密切相關(guān)[1]。關(guān)于大鼠單側(cè)耳蝸毀損后下丘中央核突觸素的表達(dá)，國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，但雙側(cè)耳蝸毀損后下丘核GAP-43的表達(dá)變化目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)機(jī)械毀損大鼠的雙側(cè)耳蝸建立大鼠雙側(cè)耳蝸去傳入損傷模型，觀察耳蝸毀損后不同時(shí)間下丘GAP-43的表達(dá)及意義，探討雙側(cè)耳蝸去傳入損傷大鼠下丘發(fā)生的可塑性變化及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供成年健康SD大鼠35只，雌雄不拘，體重200～220 g，耳廓反應(yīng)靈敏，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為7組，每組各5只動(dòng)物，分別為對(duì)照組和耳蝸毀損后3、7、14、21、28 、90天組。

1.2雙側(cè)耳蝸毀損術(shù) 10%水合氯醛(0.35 ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉動(dòng)物，按Alvarado法[3]行雙側(cè)耳蝸毀損，即無(wú)菌條件下，取耳后下切口，暴露并打開(kāi)聽(tīng)泡，暴露耳蝸，用顯微剝離子毀損耳蝸，吸除殘留的耳蝸內(nèi)容物，填塞明膠海綿后縫合。對(duì)照組在去除聽(tīng)泡腹后側(cè)壁后即行縫合。術(shù)畢各組立即肌注青霉素160萬(wàn)u/kg,分籠喂養(yǎng)。

1.3組織切片的制備 于術(shù)后3、7、14、21、28 、90天分別處死各組動(dòng)物，完成雙側(cè)下丘組織切片。方法：10%水合氯醛(0.35 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉下，打開(kāi)腹腔，自心尖部插入灌注針頭至主動(dòng)脈升部，并用血管鉗夾住動(dòng)脈內(nèi)的針頭以免滑出，剪開(kāi)右心耳，先快速注入4℃含肝素(20 U/ml)的生理鹽水200 ml沖洗，繼而灌注固定液4%多聚甲醛液400 ml，先快后慢，共30分鐘，至大鼠全身變硬，隨即斷頭，取腦前在解剖顯微鏡下驗(yàn)證耳蝸毀損的程度，然后開(kāi)顱取出雙側(cè)下丘，再在40 g/L多聚甲醛液中后固定4小時(shí)，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)冠狀位切片(片厚4 μm)，置于多聚賴氨酸包被的載玻片上,干燥后置于4℃冰箱用于GAP-43的免疫組化染色。

1.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 鼠抗GAP-43單克隆抗體及SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。切片常規(guī)脫蠟至水化，依次加入3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10分鐘，微波抗原修復(fù)，5%正常山羊血清室溫下封閉20分鐘，加兔抗山羊GAP-43(武漢博士德)，濕盒4℃過(guò)夜；以PBS洗3次，每次2分鐘，加生物素標(biāo)記二抗(山羊抗小鼠IgG),室溫20分鐘；以PBS洗3次，每次2分鐘，加入第三抗體液(SABC,來(lái)自SABC試劑盒)室溫20分鐘；以PBS洗4次，每次5分鐘，滴加DAB室溫顯色10～15 min，顯微鏡下控制。自來(lái)水沖洗，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。

光鏡下觀察下丘核GAP-43在細(xì)胞內(nèi)的分布，其陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒樣；免疫組化染色圖像分析用Olympus顯微攝像系統(tǒng)采集圖片，采用灰度測(cè)量法，采集的圖像均在同一光強(qiáng)度、同一放大倍數(shù)進(jìn)行。采集下丘核細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物，每張切片取五個(gè)不同的視野，采用千屏醫(yī)學(xué)圖文顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析，最后取五個(gè)數(shù)值的平均值為每張切片的平均灰度值，平均灰度值越低，其表達(dá)程度越高。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0分析軟件，運(yùn)用單因素方差分析比較各組間差異進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1大鼠雙側(cè)耳蝸毀損后不同時(shí)間下丘核細(xì)胞內(nèi)GAP-43的表達(dá)如圖1～7所示，從圖中可見(jiàn)：對(duì)照組大鼠的下丘核細(xì)胞的GAP-43陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞漿，呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒樣，分布較均勻，耳蝸毀損后各組下丘核細(xì)胞的GAP-43陽(yáng)性產(chǎn)物的分部部位與對(duì)照組相同，只是細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性產(chǎn)物的密度和有陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目有不同程度的增加。

圖1 假手術(shù)對(duì)照組下丘GAP-43表達(dá) (免疫組化染色×400)圖2 耳蝸毀損后3天組下丘GAP-43表達(dá) (免疫組化染色×400)圖3 耳蝸毀損后7天組下丘GAP-43表達(dá) (免疫組化染色×400) 圖4 耳蝸毀損后14天組下丘GAP-43表達(dá) (免疫組化染色×400)

2.2各組雙側(cè)耳蝸毀損后不同時(shí)間下丘核GAP-43免疫組化染色圖像分析的平均灰度值見(jiàn)表1。

表1 各組下丘核GAP-43平均灰度值(n=5只)

注：* 與對(duì)照組比較，P>0.05

從表1可見(jiàn)，雙側(cè)耳蝸毀損后3天GAP-43表達(dá)升高， 7、14天其表達(dá)持續(xù)上升，14天時(shí)上升達(dá)高峰，21、28天逐漸下降，到毀損后90天GAP-43水平略高于正常組。單因素方差分析顯示：除術(shù)后90天組外，其余各組與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組動(dòng)物左右兩側(cè)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

下丘核(IC)是最重要的聽(tīng)中樞皮質(zhì)下會(huì)聚站, 在聲信號(hào)處理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中所有上行和下行投射纖維均在 IC形成專(zhuān)一性突觸(obligatory synapse),這種聯(lián)系既有興奮性突觸(excitatory synapse)也有抑制性突觸(inhibitory synapse)[4]。研究表明，在強(qiáng)純音聲損傷前后檢測(cè)灰鼠耳蝸單個(gè)神經(jīng)元功能活動(dòng)的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，約半數(shù)下丘神經(jīng)元在受到純音損傷后表現(xiàn)更為活躍，自發(fā)放電率增加[5～8]，說(shuō)明在中耳及內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化的同時(shí)，聽(tīng)覺(jué)中樞也相應(yīng)發(fā)生了改變，即發(fā)生了可塑性(plasticity)的改變或重組(reorganization)。在參與聽(tīng)覺(jué)信號(hào)的傳遞過(guò)程中下丘核-耳蝸聲信號(hào)通路有多種蛋白、酶等參與，切除一側(cè)或者雙側(cè)耳蝸將引起它們的改變或重新分布。耳蝸切除后除了下丘核-耳蝸聲信號(hào)通路遞質(zhì)、受體以及參與調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白等發(fā)生相應(yīng)的改變外，也可導(dǎo)致該通路的結(jié)構(gòu)、電生理功能出現(xiàn)相應(yīng)的重塑，以適應(yīng)耳蝸切除后的改變，維持結(jié)構(gòu)、生理和功能的平衡[9，10]。

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白是一種分子量為23.6KD的突觸前膜蛋白、神經(jīng)調(diào)素，被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育和再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子和標(biāo)志性蛋白[11]。GAP-43在腦中分布廣泛但不均一，在大多數(shù)成熟神經(jīng)元，其表達(dá)水平低或?yàn)殛幮裕谏窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育與再生過(guò)程中，GAP-43的合成顯著增高。生長(zhǎng)錐膜上GAP-43含量的表達(dá)與軸突生長(zhǎng)相一致，可反映軸突生長(zhǎng)及突觸形成所處的大致?tīng)顟B(tài)。有作者在大鼠迷路損傷后不同時(shí)期觀察到前庭核中GAP-43mRNA水平的不同變化，提示GAP-43mRNA水平的提高可能與前庭代償中突觸重組和神經(jīng)可塑性相關(guān)[12]。在軸突外生和突觸形成時(shí)，GAP-43蛋白高水平表達(dá)，這種高水平維持整個(gè)大腦發(fā)育期的突觸可塑性過(guò)程[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠的雙側(cè)耳蝸毀損后，GAP-43的表達(dá)有先增高達(dá)到峰值后逐漸降低的趨勢(shì)，推測(cè)GAP-43免疫活性的增高可能與軸突再生、突觸重建相關(guān)。可能是在正常神經(jīng)元，由靶器官產(chǎn)生的抑制性信號(hào)通過(guò)逆行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，抑制GAP-43表達(dá)；而外周神經(jīng)損傷后，損傷局部正反饋信號(hào)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體或由胞體本身產(chǎn)生的正反饋信號(hào)刺激了GAP-43的表達(dá)[14，15]。此外，神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，機(jī)體可能啟動(dòng)了潛伏狀態(tài)的神經(jīng)元軸突，GAP-43mRNA轉(zhuǎn)錄增加，GAP-43表達(dá)增強(qiáng)，使?jié)摲跔顟B(tài)的突觸轉(zhuǎn)化成活細(xì)胞狀態(tài)，1～2周后，潛伏期狀態(tài)的細(xì)胞全部活化，GAP-43表達(dá)也達(dá)到最高水平，軸突再生、突觸重建也達(dá)到最迅速時(shí)期；之后負(fù)反饋信號(hào)占主導(dǎo)作用，部分細(xì)胞開(kāi)始逐漸失活，GAP-43表達(dá)逐漸下降，其免疫活性也下降。Michler等[16]發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)聲損傷或耳蝸切除的大鼠，毀壞其Corti器后，術(shù)側(cè)外側(cè)橄欖體(LSO)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白在術(shù)后3天微量表達(dá)，術(shù)后9天表達(dá)較強(qiáng)，第三周達(dá)到高峰，持續(xù)約1.5年；在對(duì)側(cè)LSO，其生長(zhǎng)相關(guān)蛋白陽(yáng)性反應(yīng)術(shù)后3～16天升高，持續(xù)1年。研究還發(fā)現(xiàn)，在過(guò)度聽(tīng)覺(jué)刺激后，GAP-43的陽(yáng)性細(xì)胞在IC、耳蝸前腹核也有變化。Chen等[17]研究表明，在單側(cè)耳蝸毀損后2天，耳蝸前復(fù)核GAP-43表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差別，術(shù)后4天明顯增加，8天達(dá)高峰，14天時(shí)比4天時(shí)弱，28天仍比對(duì)照組高，60天有繼續(xù)下降的趨勢(shì)。Mossop[18]等發(fā)現(xiàn)成年沙鼠一側(cè)耳蝸切除后24 h和7 d，術(shù)耳對(duì)側(cè)IC的GAP較同側(cè)明顯減少，但是在術(shù)后4 h和一年進(jìn)行檢測(cè)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)上述改變。Illing[19]等發(fā)現(xiàn)，單側(cè)耳蝸切除后，GAP-43在同側(cè)上橄欖核急劇上升，而在其它聽(tīng)覺(jué)腦干核團(tuán)則下降，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在耳蝸切除后上橄欖核中GAP-43 mRNA表達(dá)增高的神經(jīng)元其蛋白質(zhì)免疫活性也高。相反，在術(shù)耳對(duì)側(cè)IC中GAP-43表達(dá)mRNA的表達(dá)則明顯減低，認(rèn)為上橄欖復(fù)合體參與了耳蝸切除后聽(tīng)覺(jué)腦干的重塑過(guò)程。

GAP-43的獨(dú)特性質(zhì)在于它是突觸前末端的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白，生長(zhǎng)錐膜上GAP-43的表達(dá)與軸突生長(zhǎng)相一致，從而可反映出軸突生長(zhǎng)及突觸形成所處的大致?tīng)顟B(tài)。本實(shí)驗(yàn)只研究了大鼠雙側(cè)耳蝸毀損后三個(gè)月內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的GAP-43表達(dá)變化，對(duì)耳蝸毀損后中樞可塑性機(jī)制進(jìn)行初步探討，至于一年后或更長(zhǎng)時(shí)間的變化有待進(jìn)一步深入研究。

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