諸葛春耕 張 燎

(泰安市口腔醫(yī)院，山東 泰安 271000)

骨髓基質(zhì)潛能細胞作為骨組織工程的種子細胞越來越引起人們的關(guān)注，對骨髓基質(zhì)潛能細胞的研究集中在細胞的分離純化、細胞的培養(yǎng)、細胞的標記、誘導因子及其基因轉(zhuǎn)染對細胞的生物學影響，而細胞與生物材料的結(jié)合是骨組織工程臨床應用的基礎(chǔ)，本實驗通過體外培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)潛能細胞觀察研究細胞對支架材料的貼附能力及材料對細胞的影響，從而為骨組織工程技術(shù)的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實驗用品 0.25%胰酶(Sigma)， 新生牛血清(杭州四季清)，37 ℃ 5%CO2細胞孵育箱(美國Forma公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus)， I型膠原I抗[calbiochem anti-Collagen, Type I (Ab-1), Human (Rabbit )]、免疫組化SABC試劑盒(武漢博士德)，新西蘭大白兔(山東省農(nóng)科院兔場提供)，茜素紅(Sigma)，bio-oss(瑞士蓋氏制藥有限公司)。

1.2骨髓基質(zhì)潛能細胞的分離與培養(yǎng)[1]2～4周齡雄性新西蘭大白兔脫頸處死,75%酒精浸泡20～30 min，在后肢膝關(guān)節(jié)處，切開表皮,剖開關(guān)節(jié),去除無用的關(guān)節(jié)韌帶、關(guān)節(jié)盤、顯露關(guān)節(jié)面，以預備的PBS(含105U/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素)沖洗2遍后, 去除垢端顯露髓腔，用7號注射針頭吸取PBS沖洗骨髓腔以獲取骨髓細胞的沖洗液，反復沖洗至骨腔發(fā)白后，停止沖洗。以100目的鐵網(wǎng)過濾雜質(zhì),以1500～2000 r/min離心,管內(nèi)沉淀用PBS沖洗1遍后,以含有20%胎牛血清的DMEM重新懸浮細胞,接種至50 ml玻璃培養(yǎng)瓶,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃,5%CO2培養(yǎng)，5 d后半量換液，以后2～3 d全量換液1次。待原代培養(yǎng)的細胞增殖至鋪滿瓶底時，在37℃室溫下用0.25%胰蛋白酶消化5 min，使之成為單細胞懸液，以1×104/cm2密度接種于50 ml培養(yǎng)瓶。待培養(yǎng)的細胞增殖至第四代時加入含誘導劑的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素各100 U/ml、維生素C 50 μg/ml、地塞米松10 μmol/L,β-甘油磷酸鈉10 mmo1/L )10 ml以1×104/cm2密度接種于50 ml培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察,每日觀察細胞生長情況及形態(tài)變化特點。待誘導的細胞長滿培養(yǎng)瓶后離心、收集，以1×108滴加到鋪滿bio-oss的四孔板中，6 h后再向四孔板中滴加足量的培養(yǎng)基。以電鏡掃描細胞在材料表面的貼附情況。

1.3誘導細胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 誘導細胞在6孔板中,待爬片細胞長至70%～80%匯合時(12天左右),棄去培養(yǎng)基以冷丙酮固定20～30 min后吸出,加入0.1%茜素紅，室溫下25～30 min、沖洗,顯微鏡下觀察細胞及鈣結(jié)節(jié)染色。

1.4MTT法測生長率[2]取第II代誘導后的骨髓基質(zhì)潛能細胞胰酶消化后,計數(shù),以3×103/L接種于24孔板中,每孔200 μl,無載體材料骨髓基質(zhì)潛能細胞作為對照組，鋪有bio-oss的骨髓基質(zhì)潛能細胞作為實驗組,在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng),測前每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl,再培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min,在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長,測各孔的吸光光度值每天測3孔,取其均值。

1.5I型膠原的測定 免疫組化法:取V代實驗與對照組細胞,以1×105/L爬片,長至80%～90%融合時,進行免疫組化的SABC I型膠原檢測。4%多聚甲醛固定10～30 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加適當稀釋的一抗,加SABC復合物室溫作用20 min，PBS洗5 min,DAB顯色;鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1骨髓基質(zhì)潛能細胞的細胞形態(tài)學觀察 在頭3d內(nèi)培養(yǎng)皿內(nèi)漂浮大量的血細胞，3 d后首次半換液，觀察可見培養(yǎng)瓶壁上有成纖維樣細胞散在分布，其形狀、大小各不相同。7～14 d可見少量的集落形成，這些細胞被稱為成纖維細胞集落形成單位(colony forming unitfibroblastic, CFU-F)，細胞集落的中央部位細胞分布較密，外周細胞密度降低。高倍鏡下觀察貼壁細胞,呈短棒狀、短梭形,胞核漿分界清晰,折光性強。一般胞核位于胞體膨大部的中央,單核仁居多,胞體可有不規(guī)則突起，此時細胞相互間緊密貼附,從整體來看大多數(shù)細胞沿胞體長軸呈有序排列，10 d時培養(yǎng)瓶內(nèi)成纖維細胞集落數(shù)目增多，并且集落的直徑增大，有的集落區(qū)部分細胞老化，15 d時觀察見細胞基本鋪滿瓶底。用0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)，骨髓基質(zhì)潛能細胞傳代后生長更加迅速,一般4～5 d可傳代一次。傳代細胞形態(tài)仍呈多角形、短梭形；傳至20代后，生長速度逐漸減慢，傳代周期延長、細胞輪廓增強、細胞變得粗糙、胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀堆積物，放棄培養(yǎng)。細胞加入礦化液后仍繼續(xù)生長繁殖,單個細胞形態(tài)變化不明顯,但多角形細胞最為多見，細胞長滿時相互間鑲嵌排列,呈現(xiàn)鵝卵石樣外觀。細胞滴加到載體材料后，6 h后可見細胞開始舒展，并貼附于bio-oss上，24 h后可見大量新生的增殖細胞(圖 1)。6～7天時，可見細胞在材料上成一定方向配列生長。

圖1 bio-oss及貼附細胞的電鏡掃描照片

2.2MTT法測生長率 誘導細胞通過MTT法測其第II代細胞的增殖率,并與非誘導空白對照組作對照，其數(shù)值如表1。

表1 骨髓基質(zhì)干細胞MTT結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計學分析，實驗組和對照組第1～7天其第II代細胞的增殖率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3細胞鈣化結(jié)節(jié) 茜素紅染色結(jié)果顯示礦化液誘導后細胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團塊，呈現(xiàn)片狀的棕染,著色區(qū)域范圍廣、面積大，如圖 2。

2.4檢測發(fā)現(xiàn)I型膠原SABC免疫組化結(jié)果在誘導細胞及空白細胞中陽性有差別,實驗組強于對照組(圖 3)。

圖2 誘導后的骨髓基質(zhì)潛能細胞茜素紅染色(×4)

圖3 I型膠原的SABC免疫組化測定光鏡下(×4)

3 討 論

從目前研究狀況來看,組織工程成骨要求體外支架材料上必須接種相當量的成骨細胞,一般量要達到107/ml數(shù)量級左右。從目前研究[3]進展來看,可通過各種分離純化的方法提取骨髓基質(zhì)潛能細胞中的骨祖細胞及前成骨細胞,也可以施加各種因素誘導骨髓基質(zhì)潛能細胞向成骨細胞分化，其中骨形成蛋白和地塞米松的誘導作用已得到了大家的公認[4]。我們應用的礦化液中加入了Vit C和β-甘油磷酸鈉、地塞米松，主要目的是促使骨髓基質(zhì)潛能細胞向成骨細胞分化,合成細胞外基質(zhì)并進一步礦化形成礦化結(jié)節(jié)。結(jié)果顯示骨髓基質(zhì)潛能細胞經(jīng)礦化液誘導后，細胞內(nèi)I型膠原含量顯著性增高,同時細胞間形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多,表現(xiàn)出成骨細胞的生物學特性,說明在礦化液定向誘導下骨髓基質(zhì)潛能細胞向成骨細胞方向分化能力增強,成骨細胞數(shù)量明顯增多。本實驗結(jié)果表明，礦化液可使其向成骨細胞轉(zhuǎn)化,但增殖速度變慢,如何更好地控制骨髓基質(zhì)潛能細胞增殖與分化的關(guān)系及與基因工程相結(jié)合是我們進一步研究的方向[5]。成骨細胞種植的細胞外基質(zhì)材料的選擇是骨組織工程研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是限制。理想的骨組織工程細胞外基質(zhì)材料的要求有：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性；(3)具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)；(4)可塑性和一定的機械強度；(5)良好的材料——細胞界面。Bio-oss骨屬于生物類材料中的異種骨，由于其天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)未受明顯破壞，仍保留原骨的骨小梁、小粱間隙及骨內(nèi)管腔系統(tǒng)，骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)依然存在，較之化學合成生物材料有其固有的優(yōu)勢。這種天然結(jié)構(gòu)有利于組織細胞粘附、生長，并為細胞外基質(zhì)分泌提供寬大的內(nèi)部空間及表面積，加上其無機成分主要為羥基磷灰石，與人骨的天然成分相同，因此Bio-oss有良好的生物相容性。由于Bio-oss骨組織結(jié)構(gòu)在不同種屬動物間存在高度同源性，異種骨植入體內(nèi)后易于被宿主組織細胞接近而爬行替代，顯示良好的生物降解性，這方面已有國內(nèi)學者進行了研究；但Bio-oss不含有機成分，因而疏松易碎，不具備基本機械強度。本實驗通過誘導細胞的貼附研究進一步從基礎(chǔ)理論的微觀方面證明了Bio-oss良好的生物相容性，可以作為骨組織工程對骨組織缺損的良好的種子細胞載體。如果在未來的研究中增強其機械強度將有極其廣闊的應用前景。

[1] 楊志明.組織工程[M].北京:化學工業(yè)出版社, 2002：126-130.

[2] 司徒振強,吳軍正.細胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版社西安公司, 2004：267-269.

[3] 楊興華,劉云生.骨髓基質(zhì)干細胞的研究現(xiàn)狀及其展望[J].泰山醫(yī)學院學報, 2005, 26(6): 604-606.

[4] 席慶,毛天球,曹罡,等.成人骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)與鑒定[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志, 2002, 16(5): 385-387.

[5] 許燕凱,楊應明.骨髓基質(zhì)干細胞與成骨的研究進展[J].汕頭大學醫(yī)學院學報, 2003, 16(1): 57-59.