鄭冠琳，亓文波，楊利波

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰安醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 泰安 271000)

糖尿病是冠心病的等危癥。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者患心血管病的幾率高2～4倍[1]。高血糖與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，然而反映血糖水平的金指標(biāo)HbA1c卻顯示與心血管終點(diǎn)事件有弱相關(guān)性[2]。相反，近來(lái)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，餐后高血糖是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]，血糖波動(dòng)與糖尿病大血管病變相關(guān)性的大型流行病學(xué)研究結(jié)果也提示餐后高血糖較恒定血糖水平更能加劇糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[4]。而血糖波動(dòng)與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及機(jī)制的研究目前尚處于初步階段。眾所周知，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與MMP-9密切相關(guān)[5]。MMP-9是明膠酶的一種，它可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，目前許多研究證實(shí)血清MMP-9水平與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈病變程度及斑塊的穩(wěn)定性關(guān)系密切[6，7]。在體內(nèi)，MMP-9可被多種細(xì)胞分泌，尤以巨噬細(xì)胞作用最強(qiáng)。本研究通過(guò)分析高血糖及血糖波動(dòng)對(duì)巨噬細(xì)胞分泌MMP-9的影響，探討血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其分子學(xué)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用不同的葡萄糖濃度及糖濃度波動(dòng)干預(yù)巨噬細(xì)胞，以此模擬血糖波動(dòng)的體外模型，利用RT-PCR技術(shù)測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-9的不同表達(dá)，了解高糖及糖波動(dòng)對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心。用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)THP-1至106/ml時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)基，加PMA(至終濃度為100 nmol/L)，孵育24小時(shí)，獲得單核巨噬細(xì)胞。

1.2 干預(yù)細(xì)胞

配置葡萄糖濃度分別為5 mmol/L、15 mmol/L的1640培養(yǎng)液和相同濃度的甘露醇的1640培養(yǎng)液，第一、二組分別用5 mmol/L和15 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時(shí)，第三組先用5 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，然后換15 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，以此為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)三個(gè)循環(huán)。第四組應(yīng)用甘露醇培養(yǎng)液，換液方式同第三組。

1.3 半定量RT-PCR法測(cè)定四組中MMP-9mRNA的表達(dá)量

Trizol法提取細(xì)胞總RNA,RNA濃度以Nanovue超威量分光亮度計(jì)重復(fù)測(cè)量3次,A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0,取1.0 μg總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)16為引物按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。MMP-9的引物為：有意義序列引物5’-CCGCA GGGCCCCTTCCTTAT-3’,反義序列引物5’-GCCCACTTGGT CCACCTGGTT-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增引物全長(zhǎng)為438 bp。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增GAPDH引物為：有意義引物序列5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，下反義序列引物: 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’,預(yù)計(jì)擴(kuò)增引物全長(zhǎng)為268 bp,均由Invitrogen公司合成。取5 μl聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳并用BandScan做圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PMA處理THP-1后細(xì)胞形態(tài)的變化

倒置顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞可見(jiàn)單核細(xì)胞呈圓形半懸浮狀生長(zhǎng)，經(jīng)PMA孵育6 h后，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變，由懸浮型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁型，到24 h時(shí)基本貼壁，Giemsa染色后見(jiàn)細(xì)胞體積增大，形態(tài)多樣，由圓形變?yōu)樗笮?、橢圓形或不規(guī)則形。胞核較小，呈卵圓形或腎形。胞質(zhì)豐富，含有空泡和著色顆粒。

M Marker

1 對(duì)照組 2 高糖組

3 甘露醇組 4 糖波動(dòng)組

圖1 RT-PCR 電泳結(jié)果

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)MMP-9mRNA的表達(dá)

半定量RT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)不同培養(yǎng)液干預(yù)后巨噬細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)明顯不同，實(shí)驗(yàn)組MMP-9mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，對(duì)照組巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-9mRNA表達(dá)量為(0.531±0.044)，高糖組較對(duì)照組明顯增高[(0.627±0.041vs0.531±0.044)，(P<0.01)]；甘露醇組高于高糖組[(0.823±0.036 vs 0.627±0.041),(P<0.01)]；糖波動(dòng)組高于甘露醇組[(0.897±0.030 vs 0.823±0.036)，(P<0.01)]。

表1 4組間結(jié)果比較

注：與對(duì)照組比較，﹡P<0.01；與高糖組比較，﹡﹡P<0.01；與甘露醇組比較，﹡﹡﹡P<0.01。

3 討 論

本試驗(yàn)采用不同的糖濃度及糖濃度波動(dòng)培育巨噬細(xì)胞，以此模擬血糖波動(dòng)的體外模型，探討血糖波動(dòng)及高血糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌MMP-9的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高糖環(huán)境的干預(yù)下巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-9的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，而糖波動(dòng)組MMP-9mRNA表達(dá)量較高糖組顯著增加，從細(xì)胞水平提示血糖波動(dòng)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。

高糖及糖波動(dòng)使MMP-9分泌增多，分析其原因可能有以下幾個(gè)方面：(1)高糖通過(guò)激活蛋白激酶C觸發(fā)了氧化應(yīng)激,使對(duì)氧化應(yīng)激敏感的核因子-κB(NF-κB)等多種細(xì)胞因子激活，啟動(dòng)了MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄[8]。持續(xù)高糖會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生慢性適應(yīng)，通過(guò)自身反饋調(diào)節(jié)降低或部分消除了高糖毒性，間斷暴露于高濃度葡萄糖環(huán)境下,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞適應(yīng)能力受損, 氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，分泌更多的MMP-9。(2) 本實(shí)驗(yàn)還設(shè)計(jì)了甘露醇組，甘露醇與葡萄糖分子量十分相近，但是細(xì)胞外環(huán)境中的葡萄糖可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)在多種酶的參與下進(jìn)行代謝，而甘露醇則很少進(jìn)入細(xì)胞代謝，因此，采用相同濃度的甘露醇以及與波動(dòng)組相同的方式培養(yǎng)細(xì)胞，相當(dāng)于單純模擬了波動(dòng)組的細(xì)胞外滲透壓環(huán)境。結(jié)果甘露醇組巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)量較高糖組高，較糖波動(dòng)組低。考慮高糖及糖波動(dòng)對(duì)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響與滲透壓有關(guān)，但滲透壓又不是唯一的影響因素，推測(cè)高糖及糖波動(dòng)增加單核巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-9mRNA的機(jī)制除了滲透壓的改變外還可能存在其他途徑，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

急性心血管事件的發(fā)生多為易損斑塊的破裂。目前許多研究證實(shí)，易損斑塊的破裂和MMP-9密切相關(guān)[5]。也有研究表明，在人類(lèi)硬化性動(dòng)脈的斑塊肩部及泡沫細(xì)胞聚集區(qū)顯示了MMP-9的表達(dá)增高，且所有的斑塊抽提物被證實(shí)含有MMP-9的活化形式[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌更多的MMP-9,提示血糖波動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定甚至破裂。這提示臨床工作中對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化患者應(yīng)平穩(wěn)降糖，避免血糖波動(dòng)過(guò)大。

本實(shí)驗(yàn)提示，高糖環(huán)境可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌MMP-9，糖波動(dòng)較高糖更能增加巨噬細(xì)胞分泌MMP-9，從而加速AS的形成，造成斑塊的不穩(wěn)定及破裂。提示臨床應(yīng)該平穩(wěn)降糖，減少血糖漂移，真正做到“優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)”。

[1] Stamler J, Vaccaro O, Neaton JD, et al. Diabetes, other risk factors, and 12-yr cardiovascular mortality for men screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial[J]. Diabetes Care. 1993,16:434-444.

[2] Stratton IM, Adler AI, Neil HA, et al. Association of glycaemia with macrovascular and microvascular complications of type 2 diabetes (UKPDS 35): prospective observational study[J]. BMJ. 2000,321:405-412.

[3] Temelkova-Kurktschiev TS, Koehler C, Henkel E, et al.Postchallenge plasma glucose and glycemic spikes are more strongly associated with atherosclerosis than fasting glucose or HbA1c level[J]. Diabetes Care. 2000,23:1830-1834.

[4] DECODE Study Group,on behalf of the European Diabetes Epidemiology Study Group. Consequences of the new diagnostic criteria for diabetes in older men and women[J].Diabetes Care,1999,22(10):1667-1671.

[5] Risso A, Mercuri F, Quagliaro L, et al. Intermittent high glucose enhances apoptosis in human umbilical vein endothelial cells in culture[J].Am J Physiol Endocrinol Metab, 2001, 281: E924-E930.

[6] TL, Joseph AM. Extracellular matrix-driven matrix metallopteinase production in endothelial cells: implications for angiogenesis[J].Trends Cardiovasc Med,1999, 9:70-77.

[7] Jones CB, Sane DC, Herrington DM.Matrix metalloproteinases: a review of their structure and role in acute coronary syndrome[J]. Cardiovasc Res, 2003, 59(4): 812-823.

[8] Ghanim H,Aljada A,Hofmeyer D,et al. Circulating mononuclear cells in the obese are in a proinflammatory state[J]. Circulation, 2004, 110(12): 1564-1571.

[9] Ikawa M,Rabkin E,Sugiyama S,et al.An HMG-CoA reductase inhibitor,cerivastatin,suppresses growth of macrophages expressing matrix metalloproteinases and tissue factor in vivo and in vitro[J]. Circulation. 2001,103:276-283.

[10] Galis ZS, Sukhova GK, Lark MW, et al. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques[J]. J Clin Invest,1994, 94(6): 2493-2503.