王亞琳,張湘燕,王壓娣,車小燕,郭曉奎

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,上海 200025; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所,廣州 510282

鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)屬螺旋體目、鉤端螺旋體科、鉤端螺旋體屬。鉤體呈細(xì)長(zhǎng)絲狀、圓柱螺旋形。侵入人體以黏膜和皮膚途徑最為常見[1]。致病性鉤體至少可分為16個(gè)基因種、25個(gè)血清群、260多個(gè)血清型,可引起鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)。鉤體病是世界范圍內(nèi)流行最廣泛的人畜共患病之一,動(dòng)物宿主達(dá)200余種,是潛在的世界性公共衛(wèi)生問題,我國(guó)在1953年已將其列為乙類法定傳染病。2003年,我國(guó)完成第1株致病性鉤體的基因組測(cè)序工作[2]。到目前為止,完成測(cè)序的鉤體株已有6株,為鉤體的各項(xiàng)研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

鉤體病的臨床癥狀多變,極易與其他疾病混淆[3],故早期實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于有效治療、監(jiān)控鉤體病具有十分重要的作用。鉤體病血清學(xué)診斷方法包括顯微凝集試驗(yàn)(microscopic agglutination test,MAT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等,用于檢測(cè)患者血清中針對(duì)鉤體的特異抗體水平,但不能很好區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染。檢測(cè)鉤體抗原的方法,如培養(yǎng)法因耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低而不宜用于早期快速診斷;核酸檢測(cè)法,如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求高,且特異性低,存在較高的假陽(yáng)性。

LipL32是迄今為止已知的鉤體外膜中含量最豐富的暴露蛋白,是致病性鉤體的保守蛋白,有很好的免疫原性,被認(rèn)為是最好的診斷抗原之一,靈敏度和特異度均可達(dá)到90%以上[4]。本實(shí)驗(yàn)嘗試制備LipL32的單克隆抗體并篩選出其中可用于檢測(cè)的,以期能克服現(xiàn)有鉤體抗原檢測(cè)中靈敏度和特異度較低等缺點(diǎn),為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)鉤體抗原提供可能。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用在中國(guó)流行的15株致病性鉤體株及1株腐生型株(表1),均來源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制研究所。EMJH培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[3]配置;RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine surum,FBS)、DMEM培養(yǎng)基、慶大霉素購(gòu)自Gibco公司,十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)購(gòu)自TaKaRa公司,福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、50%聚乙二醇1450(polyethylene glycol 1450,PEG1450)、HAT營(yíng)養(yǎng)選擇培養(yǎng)基〔含次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)〕、HT營(yíng)養(yǎng)選擇培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma Aldrich公司,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG和IgM購(gòu)自Sigma公司,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3購(gòu)自Zymed公司,生物素購(gòu)自Pierce公司,HRP標(biāo)記的親和素購(gòu)自BioLegend公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,NTA樹脂購(gòu)自上海申能博彩公司,ELISA底物A、B液購(gòu)自上海晶美公司,酶標(biāo)板購(gòu)自康寧公司。SPF級(jí)BALB/c小鼠和NS-1細(xì)胞株購(gòu)自第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

表1中國(guó)流行的15株致病性鉤體及1株非致病性鉤體的血清群、血清型、菌株及菌號(hào)

Tab.1Fifteendominantpathogenicstrainsandonenon-pathogenicstrainofLeptospirainChina

*,the strain number of National Institute for the Control of Pharmaceu-tical and Biological Products;**, non-pathogenicLeptospirastrain.

1.2 方法

1.2.1 免疫原與檢測(cè)原的制備

1.2.1.1鉤體外膜蛋白的分離[5]用EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)黃疸出血群賴株鉤體至1×108條/ml后,4 ℃ 8 000g離心30 min;用等培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)(含5 mmol/L MgCl2)4 ℃ 8 000g,洗2次;然后加入1/20培養(yǎng)體積于4 ℃預(yù)冷的1% Triton X-114〔含150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA〕冰浴30 min,17 000g離心10 min;取上清液,加入20 mmol/L CaCl2,37 ℃孵育10 min,1 500g室溫離心10 min。有機(jī)相用4 ℃預(yù)冷的丙酮沉淀過夜,次日8 000g離心10 min,沉淀為外膜成分。

1.2.1.2非變性條件下LipL32重組蛋白的表達(dá)LipL32重組蛋白以問號(hào)鉤體黃疸出血群賴株的基因組為模板,表達(dá)載體為Pet28b,表達(dá)菌株為大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21。用1 mmol/L IPTG 22 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h,收集菌體。用1/20細(xì)菌生長(zhǎng)體積的NTA-0〔20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9)、0.5 mol/L NaCl、10% glycerol〕和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)懸浮細(xì)胞,加0.4 mg/ml溶菌酶裂解,然后加0.05% Triton X-100,充分混勻;冰上放置30 min,間或混勻,冰上超聲破碎。20 000g,4 ℃離心20 min,取上清液與NTA-0平衡好的NTA樹脂混合,4 ℃過夜。次日加入層析柱中,用含0、20、40、60、80、100、200、500 mmol/L咪唑的NTA-0溶液梯度洗脫,收集洗脫液,經(jīng)蛋白電泳和免疫印跡法鑒定洗脫液中是否含純的LipL32重組蛋白。將該洗脫液用0.01 mol/L PBS透析、濃縮,考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度。

1.2.2 單克隆抗體的制備

1.2.2.1動(dòng)物免疫BALB/c小鼠,雌性,4～6周齡,分2組,每組3只。第1組用LipL32重組蛋白免疫,每次50 μg/只。第2組用LipL32重組蛋白與抽提的外膜蛋白交替免疫,每次50 μg/只。第1次采用福氏完全佐劑,與蛋白液等體積混勻,后3次免疫采用福氏不完全佐劑,每2周免疫1次。測(cè)定小鼠血清效價(jià),分別選取2組中免疫效果最佳者于融合前3 d用LipL32重組蛋白腹腔脾內(nèi)注射加強(qiáng)免疫(100 μg)。

觀察患者的心絞痛發(fā)作情況(發(fā)病次數(shù)及時(shí)間),記錄治療前、后24 h動(dòng)態(tài)心電圖情況,結(jié)合冠心病心絞痛療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療效果評(píng)價(jià)[3],統(tǒng)計(jì)兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率。

1.2.2.2抗體效價(jià)測(cè)定免疫4次后,經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定血清中抗體效價(jià)。取LipL32重組蛋白,鉤體56601株全菌超聲裂解上清液包板,1 μg/ml,100 μl/孔,4 ℃包被16 h;封閉液(1% BSA、0.1% Tween-20)300 μl/孔,4 ℃封閉16 h,PBS-T洗板3次;血清稀釋后加樣,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗板3次;加1∶1 000稀釋的羊抗鼠HRP-IgG,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗板5次;加ELISA底物A、B液,避光37 ℃顯色10 min,2 mol/L硫酸50 μl/孔終止反應(yīng);450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。

1.2.2.3細(xì)胞融合挑選2組中免疫效果最佳小鼠,分別取出脾臟,用高溫滅菌的銅網(wǎng)研磨,收取細(xì)胞,與NS-1細(xì)胞按5∶1混合。離心,棄上清液,于37 ℃水浴中緩慢加入1 ml PEG1450,1 min內(nèi)加完,分別于1、2、3、4、5 min內(nèi)加1、2、3、4、5 ml無血清RPMI-1640終止融合;最后加入10 ml含15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,室溫300g離心5 min;棄上清液,用20 ml上述培養(yǎng)基重懸,平均分配至加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中,100 μl/孔,37 ℃培養(yǎng)。9 h后,加2.5×HAT、含15% FBS的RPMI-1640,100 μl/孔,進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。48 h后,更換為1×HAT,100 μl/孔。

1.2.2.4陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化LipL32重組蛋白、鉤體56601株全菌超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA檢測(cè)96孔板中克隆細(xì)胞分泌上清液。挑選結(jié)果為陽(yáng)性的繼續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增,以有限稀釋法亞克隆化篩選,共進(jìn)行2次篩選,篩選方法不變。將篩選出的單克隆抗體細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng),用含有空載Pet28b質(zhì)粒的(E.coli)BL21菌株超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行復(fù)測(cè),篩選出陰性的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.2.5腹水的制備與抗體的純化取10～12周齡BALB/c雌性小鼠6只,接種細(xì)胞前1周,腹腔注射降植烷0.5 ml;收集篩選出的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞,按每只小鼠給予6×105個(gè)細(xì)胞腹腔注射接種;待小鼠腹部脹大后(接種1～2周),引流腹水,可收集多次。采集的腹水采用辛酸/硫酸銨分步沉淀法提純。提純抗體經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測(cè)定純度。

1.2.3 單克隆抗體生物學(xué)特性的鑒定

1.2.3.1亞類包被LipL32重組蛋白于96孔板中,1 μg/ml,100 μl/孔,包被、封閉。加入單克隆抗體細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清液,100 μl/孔。一抗為羊血清稀釋的羊抗鼠IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(按1∶1 000稀釋)。ELISA操作步驟同上。

1.2.3.2標(biāo)記抗體效價(jià)采用間接ELISA測(cè)定標(biāo)記生物素的單克隆抗體效價(jià),BSA包被板條作陰性對(duì)照。LipL32重組蛋白包被濃度均為1 μg/ml,HRP-親和素稀釋度為1∶1 000,其他操作步驟同上?？贵w測(cè)定A值/陰性對(duì)照A值≥2.1時(shí),抗體最低濃度即為抗體效價(jià)。

1.2.4 單克隆抗體的配對(duì)

1.2.4.1單克隆抗體標(biāo)記生物素4.4 mg/ml的生物素溶液30 μl與2 mg單克隆抗體在PBS中作用2 h,再以PBS充分透析,除去游離生物素,將標(biāo)記好的抗體凍存。

1.2.4.2單克隆抗體之間競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表位以重組LipL32蛋白1 μg/ml包板封閉,每孔先加入1 mg/ml純化的單克隆抗體50 μl,再分別加入生物素標(biāo)記的單克隆抗體50 μl,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗滌3次;加入HRP-親和素,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗滌5次;加入TMB顯色液,37 ℃避光顯色15 min,450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。以單克隆抗體對(duì)同一生物素標(biāo)記單克隆抗體的抑制為陽(yáng)性對(duì)照,以已知無關(guān)單克隆抗體對(duì)標(biāo)記單克隆抗體的抑制為陰性對(duì)照,計(jì)算各單克隆抗體間的抑制率。抑制率計(jì)算公式:(1-各孔測(cè)定值/陰性對(duì)照值)×100。抑制率>75%為相關(guān),50%≤抑制率≤75%為不完全相關(guān),25%≤抑制率<50%為不相關(guān),抑制率<25%為完全不相關(guān)。

1.2.4.3配對(duì)實(shí)驗(yàn)包被抗體10 μg/ml,封閉后檢測(cè)。采用雙抗夾心ELISA兩步法進(jìn)行29株抗體的相互配對(duì)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)LipL32蛋白設(shè)50、25、12.5、6.25、3.125 ng/μl共5個(gè)稀釋度,檢測(cè)鉤體56601株全菌超聲裂解上清液設(shè)500、250、125、62.5、31.25 ng/μl共5個(gè)稀釋度,無關(guān)蛋白為陰性對(duì)照,稀釋液為空白。所有樣品檢測(cè)加樣均為100 μl/孔。選擇檢測(cè)結(jié)果中A值均較高、空白與陰性對(duì)照值低的抗體對(duì)15株中國(guó)流行的及1株非致病性的鉤體再次檢測(cè)。選擇對(duì)該流行的15株A值高而對(duì)非致病株A值低的抗體保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.4特異性鑒定選取SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌、曲霉的全菌超聲裂解上清液作為包被抗原,用間接ELISA檢測(cè)29株單克隆抗體的特異性。ELISA操作步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE和蛋白免疫印跡法鑒定29株單克隆抗體

29株單克隆抗體細(xì)胞株是以腹腔接種小鼠制備的腹水型單克隆抗體,用辛酸/硫酸銨分布沉淀法純化,純化后單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE分析,抗體熱變性后分解為2條相同的重鏈(50×103處)和2條相同的輕鏈(25×103處),IgM的重鏈相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)偏大些。SDS-PAGE分析顯示,所得單克隆抗體純度除22號(hào)外均較高(圖1)。

M, protein molecular marker; 1-29, mAbs against LipL32.

圖129株LipL32單克隆抗體SDS-PAGE分析

Fig.1SDS-PAGEanalysisof29monoclonalantibodiesagainstLipL32

蛋白免疫印跡法檢測(cè)29株單克隆抗體,結(jié)果如圖2所示,29株單克隆抗體在30×103處有一明顯條帶,表明29株單克隆抗體均與LipL32重組蛋白發(fā)生反應(yīng),且大部分條帶單一、特異性好。陰性對(duì)照為單克隆抗體稀釋液。

圖2蛋白免疫印跡法檢測(cè)29株LipL32單克隆抗體與鉤體抗原的特異性結(jié)合

Fig.2Specificreactivityof29monoclonalantibodiesagainstLipL32withLeptospiraantigenbyWesternblotanalysis

2.2 單克隆抗體的生物學(xué)特性

29株生物素標(biāo)記的單克隆抗體經(jīng)間接ELISA檢測(cè),效價(jià)均在200 000以上,都可用來進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)。其中單克隆抗體1、2、7、10、12、18為IgG2b類,3、4、5、6、9、11、13、14、15、16、19、20、21、26、27為IgG1類,8、23、25、29為IgG2a類,24、28為IgM類,22為IgG3類,17為其他亞類。

2.3 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)公式計(jì)算出各單克隆抗體間的抑制率,從而可看出各單克隆抗體間的抗原表位是否相同或存在交叉。結(jié)果這29株單克隆抗體的識(shí)別表位可分為8個(gè)組。第1組:1、7、8、12、17、25;第2組:2、9、10、20;第3組:3、14、23、27、29;第4組:4、5、6、11、13、18、26;第5組:19、21、22;第6組:24、28;第7組:15;第8組:16。這8個(gè)組代表8個(gè)不同的抗原識(shí)別表位。

2.4 配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用LipL32重組蛋白和鉤體56601株全菌超聲裂解上清液作為檢測(cè)抗原進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn),挑選16對(duì)檢測(cè)效果較好的單克隆抗體為候選做進(jìn)一步篩選。這些單克隆抗體分別為2/b-17、2/b-26、4/b-10、6/b-10、7/b-2、7/b-10、9/b-7、9/b-26、12/b-2、12/b-10、19/b-7、19/b-10、19/b-12、20/b-7、20/b-12和27/b-10。再用15株中國(guó)鉤體流行株和1株非致病性鉤體作為檢測(cè)抗原,再次篩選候選單克隆抗體。結(jié)果19/b-12可檢測(cè)出15株中國(guó)鉤體流行株,并與1株非致病性鉤體無交叉反應(yīng);檢測(cè)LipL32重組蛋白靈敏度達(dá)1 ng/ml,與SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌和曲霉的菌體抗原無交叉反應(yīng),靈敏度與特異度均非常理想。

3 討論

LipL32是鉤體外膜中含量最豐富的蛋白,且在致病性鉤體中高度保守,在鉤體病的診斷、疫苗研制及致病機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用。MIF Bioinformatics網(wǎng)站生物信息學(xué)分析結(jié)果表明LipL32有8個(gè)抗原表位,本實(shí)驗(yàn)制備的29株單克隆抗體能識(shí)別8個(gè)不同的抗原表位,已較全面地包含LipL32的抗原表位,且這些單克隆抗體的效價(jià)在200 000以上,這既為篩選合適的單克隆抗體提供了很好的候選資源,也為鉤體病的其他研究打下了基礎(chǔ)。國(guó)際上也有LipL32單克隆抗體的文獻(xiàn)報(bào)道,這些單克隆抗體被應(yīng)用于診斷和保護(hù)性實(shí)驗(yàn),并取得了一定的效果[6]。而且本實(shí)驗(yàn)中29株單克隆抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)有8個(gè)之多,且成功配對(duì)篩選出很好的抗原檢測(cè)單克隆抗體,有著很好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)獲得了單克隆抗體19/b-12,檢測(cè)LipL32重組蛋白的靈敏度為1 ng/ml,可與國(guó)內(nèi)流行的15株致病性鉤體相關(guān)抗原發(fā)生特異性反應(yīng),而與非致病性鉤體菌體抗原無反應(yīng)。此外,它與SARS病毒、登革病毒、金黃色葡萄球菌的菌體抗原無交叉反應(yīng)。因此,該抗體可能在鉤體抗原的診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的LipL32重組蛋白在非變性條件下純化,保證了其免疫原性。由于表達(dá)載體是E.coli,為了保證篩選到特異性針對(duì)LipL32蛋白天然表位的單克隆抗體,一組小鼠全程用LipL32重組蛋白免疫,另一組小鼠用LipL32重組蛋白與鉤體外膜蛋白交替免疫,融合時(shí)選擇了2組中效價(jià)最高的各1只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后篩選到的29株單克隆抗體分別來自這2只小鼠,從抗體數(shù)量和抗原識(shí)別表位分析,此2組小鼠差異無顯著性,從而證實(shí),非變性條件下純化的LipL32重組蛋白也同樣具有很好的免疫原性。

[1] 嚴(yán)杰,戴保民,于恩庶.鉤端螺旋體病學(xué)[M].第三版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006,172-173.

[2] Ren SX, Fu G, Jiang XG, Zeng R, Miao YG, Xu H, Zhang YX, Xiong H, Lu G, Lu LF, Jiang HQ, Jia J, Tu YF, Jiang JX, Gu WY, Zhang YQ, Cai Z, Sheng HH, Yin HF, Zhang Y, Zhu GF, Wan M, Huang HL, Qian Z, Wang SY, Ma W, Yao ZJ, Shen Y, Qiang BQ, Xia QC, Guo XK, Danchin A, Saint Girons I, Somerville RL, Wen YM, Shi MH, Chen Z, Xu JG, Zhao GP. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing [J]. Nature, 2003, 422(6934): 888-893.

[3] World Health Organization. Human leptospirosis: guidance for diagnosis, surveillance and control. International Leptospirosis Socity (ILS), 2005. [C/OL]. http://whqlibdoc.who.int/hq/2003/WHO_CDS_CSR_EPH_2002.23.pdf.

[4] Flannery B, Costa D, Carvalho FP, Guerreiro H, Matsunaga J, Da Silva ED, Ferreira AG, Riley LW, Reis MG, Haake DA, Ko AI. Evaluation of recombinant Leptospira antigen-based enzyme-linked immunosorbent assays for the serodiagnosis of leptospirosis [J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(9): 3303-3310.

[5] Haake DA, Walker EM, Blanco DR, Bolin CA, Miller MN, Lovett MA. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation [J]. Infect Immun, 1991, 59(3): 1131-1140.

[6] Coutinho ML, Vasconcellos FA, Fernandes CP, Seyffert N, Seixas FK, Ko AI, Dellagostin OA, Aleixo JA. Evaluation of the anti-LipL32 monoclonal antibodies potential for use in leptospirosis immunodiagnostic tests [J]. J Immunoassay Immunochem, 2007, 28(3): 279-288.