馮曉博,姚志榮

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院皮膚科,上海200092

格特隱球菌原名為新生隱球菌格特變種,現(xiàn)已上升至種的水平,并被命名為格特隱球菌(Cryptococcusgattii)[1]。格特隱球菌在流行病學和所致感染的臨床特點上都與新生隱球菌有明顯差異[2,3]。格特隱球菌多感染免疫力正常人群,所致感染多形成肉芽腫病變,需要較長的治療周期,甚至手術(shù)清除病灶,病死率高于新生隱球菌所致感染[1],且格特隱球菌對多種抗真菌藥物敏感性較新生隱球菌低[4]。格特隱球菌主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),多引起區(qū)域性感染。然而,1999年至今在溫帶地區(qū)溫哥華島暴發(fā)的格特隱球菌病發(fā)病率是以往報道的10多倍;至2007年止,已報道感染病例218例,且感染者大部分免疫力正常[5,6]。目前,該菌已蔓延至西北太平洋地區(qū),歐洲地區(qū)也已發(fā)現(xiàn)相關(guān)病例[7-10]。本文綜述此次格特隱球菌病的流行機制。

1 分子流行病學分析

近年來,在全球范圍內(nèi)進行的大樣本調(diào)查表明,根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和DNA序列差異,格特隱球菌分為4種主要基因型,即VGⅠ～VGⅣ基因型(血清B、C型),主要基因型的地域分布和致病特點存在明顯差異[3,6,11]。2004年,Kidd等[6]對溫哥華島地區(qū)臨床株的基因型進行分析,結(jié)果表明這種高致病性的菌株屬格特隱球菌VGⅡ基因型。進一步的聚合酶鏈反應(yīng)指紋法(polymerase chain reaction fingerprinting,PCR fingerprinting)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)以及多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)結(jié)果顯示,主要致病株為VGⅡa/AFLP6A基因型(占90%左右),另外VGⅡb/AFLP6B基因型占10%左右。2007年,有報道在加拿大不列顛哥倫比亞低陸平原和美國華盛頓州西北部發(fā)現(xiàn)VGⅡa亞型感染的人和動物病例,并從環(huán)境中分離到該基因型,說明該菌已播散到鄰近區(qū)域[7-9];另外,在歐洲首次發(fā)現(xiàn)VGⅡa亞型感染病例[10]。2009年,在美國俄勒岡州發(fā)現(xiàn)由VGⅡa亞型所致的動物病例[12]。Fraser等[13]對全球范圍內(nèi)VGⅡ型菌株所做的MLST表明,VGⅡa亞型在較多位點上都具有獨特的序列特征,以此區(qū)別于世界范圍內(nèi)其他地區(qū)分離的VGⅡ型菌株,而VGⅡb亞型還出現(xiàn)于澳洲、亞洲和南美洲地區(qū)[13-15]。2008年,Feng等[16]通過PCR指紋法和4個位點的MLST,首次證實我國廣東地區(qū)臨床中存在VGⅡb亞型相似株,且患者從未出國,證實致病菌來自國內(nèi);交配試驗顯示該致病株具備交配能力。最近,另有報道稱巴西帕拉州較高的格特隱球菌病發(fā)病率也與VGⅡ型菌株有關(guān)(分離率>89%),而進一步的基因分型數(shù)據(jù)未見報道[17]。

2 致病株的來源

格特隱球菌具有異宗配合的有性生活周期,交配體系中存在α和a兩種交配型。交配過程中,交配型為α和a的單倍體細胞融合成雙核菌絲,產(chǎn)生融合的鎖狀聯(lián)合,雙核菌絲的末端分化成擔子,在擔子中進行細胞核的融合和減數(shù)分裂,產(chǎn)生重組的擔孢子(basidiospore)。有性交配后產(chǎn)生的擔孢子直徑小、易于播散,易進入并沉積于肺泡。動物實驗表明,有性繁殖產(chǎn)生的擔孢子較酵母細胞具有更強的感染力[18]。2005年,Lin等[19]研究發(fā)現(xiàn),α和α相同交配型細胞在一定條件下可以融合成α/α二倍體單核菌絲,通過減數(shù)和有絲分裂產(chǎn)生重組的擔孢子。α與α交配型菌株在同性交配時,基因組的重組頻率與α和a交配型交配時的重組率相似;且子代細胞核型大多為單倍體,少見二倍或非整倍體,表明這種交配行為并非偶然的生物學現(xiàn)象。

對溫哥華島致病株和環(huán)境株的交配型分析表明,所有VGⅡ型菌株均為α交配型,且多數(shù)具備交配能力,尤其是VGⅡa亞型[6]。為了明確溫哥華島及周邊地區(qū)VGⅡa亞型致病株的可能來源,Fraser等[13]對世界范圍內(nèi)分離的VGⅡ型菌株進行了MLST,結(jié)果顯示,溫哥華島的VGⅡa與VGⅡb亞型菌株親緣關(guān)系接近,而與其他地區(qū)分離的VGⅡ型菌株親緣關(guān)系較遠。30個位點的MLST顯示,VGⅡa與VGⅡb亞型有14個位點相同,16個不同。另外,對交配型位點SXⅠα基因序列分析后推斷,VGⅡa亞型菌株由同性交配產(chǎn)生。因VGⅡb亞型菌株還出現(xiàn)于澳洲等其他地區(qū),推斷VGⅡa亞型為起源于澳洲的VGⅡb亞型與未知VGⅡ基因型間同性交配后產(chǎn)生的重組子代。然而,Meyer等[14]對世界范圍內(nèi)160多株VGⅡ型菌株進行的PCR指紋法、AFLP分析和MLST顯示,南美洲有VGⅡa和VGⅡb亞型菌株,其中最早的分離于1986年,提出這些基因型在美洲已存在較長時間,不太可能是近期交配產(chǎn)生的。

3 毒力分析

盡管VGⅡa和VGⅡb亞型菌株在遺傳上接近,但臨床上的流行率卻又顯著不同,表明其在致病性上可能存在差異。Fraser等[13]通過建立A/Jcr小鼠吸入感染模型,證實VGⅡa亞型代表株R265毒力明顯強于R272和NT-13(VGⅡb亞型)(P<0.001),甚至強于新生隱球菌格魯比變種H99(P<0.01)。Chaturvedi等[20]通過建立BALB/c小鼠靜注感染模型,結(jié)果顯示菌株NIH444(VGⅡa亞型)的毒力強于WM276(VGⅠ基因型)(P<0.034)。就隱球菌已知毒力因子黑色素、多糖莢膜、磷脂酶和37 ℃生長進行比較,結(jié)果顯示在生成黑色素方面,因作用底物不同,菌株NIH444與WM276表現(xiàn)各異;但在磷脂酶活性、莢膜形成和37 ℃生長方面兩者相似。以上數(shù)據(jù)表明,VGⅡa亞型的高流行率與其毒力較強有關(guān);而對已知毒力因子的分析結(jié)果提示,VGⅡa亞型毒力強的原因可能與未知毒力因子或毒力基因的表達有關(guān)。2009年,Ma等[21]研究發(fā)現(xiàn),VGIIa亞型在小鼠模型中表現(xiàn)的強毒力與其線粒體基因組的高表達及其在巨噬細胞中增強的復(fù)制和寄生機制相關(guān)。

4 致病菌播散機制

格特隱球菌感染主要由宿主從環(huán)境中吸入隱球菌的酵母細胞或擔孢子引起。之前認為桉樹是格特隱球菌的棲息處,格特隱球菌感染多與環(huán)境中的桉樹有關(guān)。然而,至今已報道在除桉樹以外的較多樹種、樹根周圍的泥土、空氣、水及鳥類糞便中分離到格特隱球菌[6,7,9,22-24]。對溫哥華島的環(huán)境采樣分析顯示,當?shù)氐臉洹⒛嗤?、空氣和水中均分離到致病株VGⅡa和VGⅡb亞型,其中,VGⅡa亞型占84%,VGⅡb亞型占12%,其余為VGⅠ基因型(4%)[7]。它們在榿木、樹莓、雪松、冷杉、橡樹、櫻桃樹的標本(木屑、樹皮、樹洞等)中有較高的分離率,而桉樹標本中卻未發(fā)現(xiàn)陽性標本;相應(yīng)的,致病菌在這幾種樹的樹根周圍泥土中分離率也較高。研究表明,上層泥土樣本中的菌濃度顯著高于泥土下層(P<0.01);致病株的分離和高濃度與泥土中的低濕度和低有機碳含量呈正相關(guān)。在水標本方面,海水和淡水中均分離到致病菌;在生存實驗分析中,致病菌易存活于常溫的海水和蒸餾水中,但當溫度降為4 ℃或提高鹽濃度后,存活率顯著下降?？諝鈽吮局?菌濃度與相對濕度呈負相關(guān),致病微粒直徑≥3.3 μm的要比直徑<3.3 μm的多;陽性空氣標本多來自靠近陽性樹標本的周圍,空氣標本中菌密度均數(shù)為7 cfu/m3[7,9]。

Kidd等[25]在公共場所的水、泥土和樹標本中分離到致病菌,提示致病菌的播散可能與人類活動介導(dǎo)傳播有關(guān)。另外,從車輪、環(huán)境采樣人員的鞋上亦分離到VGⅡa和VGⅡb亞型,甚至在與鞋接觸過的物體表面分離到致病菌,說明致病菌能被動播散。與靜態(tài)狀況相比,動態(tài)情況下,樹周圍空氣中菌濃度將增高10～140倍。以上研究結(jié)果說明,車輪、鞋、木屑等物體均可成為介導(dǎo)格特隱球菌VGⅡ基因型播散的媒介物。

綜上所述,借助遺傳學手段可推斷格特隱球菌高致病性VGⅡa亞型的可能起源,不僅為闡明這次暴發(fā)流行的根源提供依據(jù),而且可預(yù)測今后格特隱球菌病流行的發(fā)生;對格特隱球菌致病株的分子流行病學分析,有利于醫(yī)療機構(gòu)對疾病的流行進行監(jiān)控;對格特隱球菌的播散情況進行調(diào)查研究,有助于闡明格特隱球菌及相似病原體的播散機制,為今后該病的防治打下基礎(chǔ)。

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