熊瑤,劉紅霞,黃巧冰

1. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣州510515; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州510515

泛素是由76個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白,在進(jìn)化上高度保守。真核生物中,泛素系統(tǒng)是個(gè)復(fù)雜的體系,主要包括泛素,26S蛋白酶體和酶系統(tǒng)E1、E2、E3等。共價(jià)連接到底物蛋白的泛素能作為信號(hào)蛋白被蛋白酶體識(shí)別并降解;而泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)非溶酶體蛋白降解的主要系統(tǒng),在許多細(xì)胞功能,如抗原呈遞、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄控制和DNA修復(fù)中起重要作用。泛素化即泛素共價(jià)連接到底物蛋白。泛素化過程包括3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng):①泛素被泛素活化酶(E1)以依賴于ATP的方式活化,其C端甘氨酸殘基與E1活化的半胱氨酸殘基之間形成一硫羥酸酯鍵;②活化的泛素通過另一個(gè)硫羥酸酯鍵被轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(E2)上;③泛素連接酶(E3)通過在泛素與底物蛋白賴氨酸殘基間形成共價(jià)鍵把泛素轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白上。其中底物的特異性認(rèn)為是由E3決定的,這是由于人類僅有1個(gè)E1；E2種類較多,且每個(gè)E2與1個(gè)或數(shù)個(gè)E3作用；而新發(fā)現(xiàn)的E3數(shù)量迅速增加,且E3僅靶向1個(gè)或數(shù)個(gè)底物。經(jīng)過幾輪的泛素化,多個(gè)泛素分子被連接到底物。一旦有達(dá)到4個(gè)以上泛素的多泛素鏈形成,底物很快被識(shí)別和降解。然而泛素化并不必然引起降解,在某些情況下泛素化可改變蛋白的生物活性或亞細(xì)胞定位,如蛋白的單泛素化也可作為內(nèi)化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào),因而泛素化在細(xì)胞中也有重要的調(diào)控作用。26S蛋白酶體是存在于幾乎所有真核細(xì)胞胞質(zhì)和核中的多接觸反應(yīng)大蛋白酶,由1個(gè)20S的中央接觸反應(yīng)核心和2個(gè)位于兩端的19S調(diào)節(jié)復(fù)合物組成。研究發(fā)現(xiàn),許多病毒利用泛素系統(tǒng)為其自身服務(wù),這涉及病毒生活史的各個(gè)階段并干擾宿主抗病毒反應(yīng)的多種方式;且多數(shù)情況下病毒在泛素連接酶的水平上調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體的功能:編碼有E3功能的結(jié)構(gòu)域或?qū)⑺拗鞯腅3導(dǎo)向新的底物[1]?，F(xiàn)就病毒利用泛素生存、增殖的方式作一綜述。

1 下調(diào)細(xì)胞表面免疫分子

盡管宿主有復(fù)雜的免疫系統(tǒng)來清除感染細(xì)胞,但病毒仍可潛伏和引起隱性感染。下調(diào)細(xì)胞表面免疫分子來減少抗原呈遞已成為病毒逃避免疫監(jiān)視的常見手段,其中泛素系統(tǒng)被有效利用以達(dá)到這一目的。

主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類分子為抗原呈遞的重要分子,病毒能通過不同的方式利用泛素系統(tǒng)抑制其呈遞過程。如人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)編碼US2和US11糖蛋白,可促使新生成的MHCⅠ類分子重鏈從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到胞質(zhì),在胞質(zhì)中被蛋白酶體降解。研究顯示,這一依賴于US2和US11的移位是需要活性泛素系統(tǒng)的[2]。卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)編碼的病毒蛋白K3為泛素連接酶,可促使MHCⅠ類分子形成多泛素鏈,進(jìn)而作為信號(hào)致使MHC Ⅰ類分子內(nèi)在化而被溶酶體降解,細(xì)胞內(nèi)的Ubc13和UbcH5作為潛在的E2酶參與其中[3]。而EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen-1, EBNA1)包含的Gly-Ala重復(fù)序列可阻止蛋白酶體對病毒蛋白的處理,抑制抗原肽呈遞的早期步驟,從而干擾MHCⅠ類的免疫應(yīng)答[4]。

同樣,MHC Ⅱ類抗原的呈遞也受泛素系統(tǒng)介導(dǎo)的抑制。如HCMV編碼的糖蛋白US2在體外實(shí)驗(yàn)中可抑制外源蛋白抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞。US2導(dǎo)致源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅱ類蛋白HLA-DR-α和HLA-DM-α快速向胞質(zhì)移位,然后由泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)降解,以致很少Ⅱ類蛋白被呈遞[5]。

此外,其他細(xì)胞表面免疫分子也可被病毒通過泛素系統(tǒng)下調(diào)。KSHV編碼的蛋白K5與K3一樣,是一種泛素E3連接酶,它能靶向除MHC Ⅰ類分子以外的多個(gè)免疫受體,使之降解,包括MHCⅠ類鏈相關(guān)基因A/B(MHC class Ⅰ chain-related molecules A/B,MIC-A/B)、CD86、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等[3]。MIC-A/B是天然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞活化受體的配基,K5通過MIC-A/B的胞質(zhì)末端賴氨酸殘基泛素化導(dǎo)致MIC-A/B從細(xì)胞膜移位至細(xì)胞內(nèi),從而下調(diào)MIC-A/B的細(xì)胞表面表達(dá)[6]。由此可見,K3和K5充當(dāng)E3連接酶不僅可幫助病毒逃避T細(xì)胞識(shí)別,還可避免進(jìn)一步被NK細(xì)胞識(shí)別。有研究表明,T細(xì)胞的協(xié)同受體CD4可被黏液瘤病毒的M153R蛋白以類似于K5的方式下調(diào)。M153R作為泛素連接酶,將泛素連接到底物蛋白的胞質(zhì)側(cè)結(jié)構(gòu)域,成為溶酶體的靶向信號(hào),其后CD4在溶酶體中降解。M153R是在痘病毒和γ-2皰疹病毒中新發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白家族,該家族還包括KSHV的K3和K5。其特點(diǎn)是有1個(gè)環(huán)指(ring finger)樣結(jié)構(gòu)域——PHD/LAP結(jié)構(gòu)域(也稱RING-CH結(jié)構(gòu)域),起泛素連接酶的作用[7-9]。CD83對樹突細(xì)胞活化有重要意義。研究顯示,被單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染后,細(xì)胞表面CD83表達(dá)水平迅速下調(diào),而有E3泛素連接酶功能的病毒即刻早期蛋白ICP0在其中扮演重要角色。轉(zhuǎn)染表達(dá)CD83和有環(huán)指E3泛素連接酶功能缺陷的變異ICP0質(zhì)粒不能降低CD83表達(dá)。抑制蛋白酶體的實(shí)驗(yàn)提示,蛋白酶體介導(dǎo)的降解在這一下調(diào)過程中也起重要作用[10]。

2 抑制細(xì)胞凋亡

當(dāng)病毒入侵時(shí),宿主細(xì)胞常啟動(dòng)凋亡程序作為一種防御機(jī)制來抑制病毒增殖,然而病毒反過來能抑制細(xì)胞凋亡,其中泛素系統(tǒng)也是其可利用的有效工具。如它可使腫瘤抑制蛋白、前凋亡蛋白等細(xì)胞與凋亡相關(guān)的因子泛素化,從而抑制凋亡。

腫瘤抑制蛋白P53是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控引起凋亡的程序在細(xì)胞生長調(diào)控中起關(guān)鍵作用。許多病毒正是通過下調(diào)P53來抑制凋亡。如人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)E6蛋白與細(xì)胞泛素連接酶E6相關(guān)蛋白作用形成復(fù)合物,使P53多泛素化及溶酶體降解[11]。KSHV編碼的vIRF4可與泛素連接酶MDM2作用,抑制MDM2的自泛素化而使其穩(wěn)定,從而增強(qiáng)P53的泛素化和蛋白酶體降解[12]。

黃杉毒蛾桿狀病毒凋亡抑制蛋白Op-IAP3能阻止被感染的昆蟲細(xì)胞凋亡。有研究顯示,Op-IAP3與果蠅前凋亡蛋白HID的共表達(dá)可導(dǎo)致HID的泛素化。體外實(shí)驗(yàn)中,重組Op-IAP3蛋白也能促進(jìn)自身和HID蛋白的泛素化,且HID的泛素化需要Op-IAP3的RING和BIR2的結(jié)構(gòu)域參與[13]。推測Op-IAP3是一個(gè)功能性的E3泛素連接酶,其泛素化細(xì)胞前凋亡蛋白可能在抗凋亡中有重要作用。

3 調(diào)控病毒轉(zhuǎn)錄

泛素系統(tǒng)與病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)和揭示,如蛋白酶體或泛素連接酶能正向調(diào)節(jié)某些病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。HPV E2蛋白對HPV基因表達(dá)調(diào)控是病毒生活周期的一個(gè)關(guān)鍵特征。Gammoh等研究顯示,E2的最佳轉(zhuǎn)錄激活子功能需要活性蛋白酶體參與,其中涉及它與泛素連接酶MDM2的相互作用。MDM2的泛素連接酶活性已被證實(shí)在提高E2功能上起作用,且當(dāng)E2與DNA識(shí)別序列結(jié)合時(shí)MDM2與E2能形成復(fù)合物。至于MDM2如何影響E2轉(zhuǎn)錄活性的具體機(jī)制仍不清楚,但Gammoh等推測它可能導(dǎo)致某些轉(zhuǎn)錄因子降解,從而增加轉(zhuǎn)錄允許和持續(xù)合成能力[14]。

然而,也有證據(jù)顯示有些泛素化過程可能直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性而不需通過蛋白酶體降解。人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活因子Tat蛋白可激活HIV-1的長末端重復(fù)序列。研究發(fā)現(xiàn),癌蛋白HDM2與Tat相互作用并介導(dǎo)其泛素化,且能正向調(diào)節(jié)其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,提示Tat的轉(zhuǎn)錄活性是被泛素激活的;而將泛素連接到Tat上,則不需HDM2即可使其具備轉(zhuǎn)錄活性,支持了泛素正向調(diào)節(jié)Tat轉(zhuǎn)錄活性不需水解的觀點(diǎn),推測泛素化能招募影響轉(zhuǎn)錄的泛素結(jié)合蛋白。由于能結(jié)合泛素化蛋白的蛋白酶體19S調(diào)節(jié)復(fù)合物對RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄延伸有重要意義,且19S復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄方面的作用在于其可作為一個(gè)不帶水解功能的、能依賴ATP展開蛋白的伴侶素,因此Tat的泛素化可能將19S復(fù)合物引向HIV-1啟動(dòng)子[15]。

4 促使病毒出芽

新生病毒顆粒通過出芽方式離開宿主細(xì)胞,進(jìn)而感染新細(xì)胞。泛素連接酶和泛素在病毒出芽中扮演重要角色,但機(jī)制不詳。人們主要利用反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行研究,并有許多證據(jù)提示泛素系統(tǒng)的可能作用。如反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中自由泛素豐富,反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白Gag的可變片段可被單或多泛素化,蛋白酶體抑制劑阻礙了編碼PT/SAP或PPXY結(jié)構(gòu)域反轉(zhuǎn)錄病毒的出芽,很可能是因?yàn)槿鄙俜核?已知的泛素連接酶結(jié)合部位能引起病毒和病毒樣顆粒釋放,病毒PPXY基序可結(jié)合特殊的HECT泛素連接酶WW結(jié)構(gòu)域,且有接觸反應(yīng)活性的泛素連接酶對編碼PPXY基序病毒的有效出芽是必要的[16]。

一些病毒編碼晚期(L)結(jié)構(gòu)域,能利用與空泡蛋白分選(vacuolar protein sorting,VPS)相關(guān)的宿主蛋白促使病毒出芽。如HIV-1通過其Gag蛋白的L結(jié)構(gòu)域結(jié)合2個(gè)E類VPS因子——TSG101和ALIX,離開受感染細(xì)胞。Chung等的研究顯示,缺少與TSG101和ALIX結(jié)合的L結(jié)構(gòu)域的HIV-1子代釋放,可被HECT泛素連接酶NEDD4L/NEDD4-2的過表達(dá)而激活,且去除內(nèi)源的NEDD4L能抑制這些缺陷病毒出芽。病毒出芽的激活依賴于NEDD4L的泛素蛋白酶體活性,且僅需最少量的HIV-1 Gag集合區(qū),證明Gag有位于p6區(qū)之外泛素依賴的順式反應(yīng)L結(jié)構(gòu)域活性。NEDD4L的激活也需要TSG101,并導(dǎo)致包括TSG101在內(nèi)的多個(gè)ESCRT-1亞單位的泛素化。Mason-Pfizer猴病毒主要通過利用PPXY的L結(jié)構(gòu)域招募NEDD4樣蛋白協(xié)助出芽,其有效出芽同樣也需要TSG101/ESCRT-1。這些現(xiàn)象提示,NEDD4L和其他NEDD4樣蛋白可能以泛素化及活化ESCRT-1為病毒出芽服務(wù)[17]。

盡管依賴于PPXY基序的病毒出芽均需泛素和泛素連接酶及E類VPS因子參與,但兩者間的相互作用關(guān)系并不清楚。由于泛素化可作為信號(hào)招募E類因子,一個(gè)通行的觀點(diǎn)是將泛素置于病毒結(jié)構(gòu)蛋白上可介導(dǎo)E類因子的招募。但最近Zhadina等研究顯示,在依賴于泛素的出芽過程中泛素所連接的是其他因子而不是病毒蛋白[16]。

除上述4種方式外,病毒還可利用泛素系統(tǒng)影響干擾素信號(hào)途徑以及自身復(fù)制、變異等達(dá)到生存、增殖的目的。此外,機(jī)體也利用泛素系統(tǒng)抵抗病毒感染。最近發(fā)現(xiàn),泛素連接酶Nrdp1能通過活化激酶TBK1和轉(zhuǎn)錄因子IRF3,增加Toll樣受體激動(dòng)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生β干擾素,且Nrdp1能直接結(jié)合TBK1并使其多泛素化,從而激活TBK1。因此Nrdp1很可能作為泛素連接酶調(diào)控Toll樣受體的應(yīng)答來清除病毒[18]。TRIM是近年來受到重視的一個(gè)蛋白家族,研究顯示它的許多成員可被干擾素誘導(dǎo)并能利用泛素連接酶活性發(fā)揮抗病毒作用。如TRIM5α可阻斷反轉(zhuǎn)錄病毒感染,推測其能與病毒衣殼相互作用并自我泛素化,TRIM5α-病毒復(fù)合物被蛋白酶體降解,導(dǎo)致病毒感染的早期阻斷[19];TRIM22被證實(shí)能以依賴其泛素連接酶活性的方式保護(hù)細(xì)胞免受腦心肌炎病毒感染,推測它可使腦心肌炎病毒編碼的重要蛋白3CPRO泛素化,從而改變其蛋白酶活性或亞細(xì)胞定位[20]。

由此可見,病毒與泛素系統(tǒng)間的相互作用復(fù)雜,后者對病毒感染有多方面的影響。深入了解病毒利用泛素系統(tǒng)的機(jī)制,有助于為研究病毒感染機(jī)制提供新的視角,并為藥物研發(fā)提供新的靶標(biāo)。

[1] Gao G, Luo H. The ubiquitin-proteasome pathway in viral infections [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2006, 84(1): 5-14.

[2] Hassink GC, Barel MT, Van Voorden SB, Kikkert M, Wiertz EJ. Ubiquitination of MHC class I heavy chains is essential for dislocation by human cytomegalovirus-encoded US2 but not US11 [J]. J Biol Chem, 2006, 281(40): 30063-30071.

[3] Nathan JA, Lehner PJ. The trafficking and regulation of membrane receptors by the RING-CH ubiquitin E3 ligases[J]. Exp Cell Res, 2009, 315(9): 1593-1600.

[4] Zhang M, Coffino P. Repeat sequence of Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 1 protein interrupts proteasome substrate processing [J]. J Biol Chem, 2004, 279(10): 8635-8641.

[5] Hegde NR, Tomazin RA, Wisner TW, Dunn C, Boname JM, Lewinsohn DM, Johnson DC. Inhibition of HLA-DR assembly, transport, and loading by human cytomegalovirus glycoprotein US3: a novel mechanism for evading major histocompatibility complex class Ⅱ antigen presentation [J]. J Virol, 2002(21), 76: 10929-10941.

[6] Thomas M, Wills M, Lehner PJ. Natural killer cell evasion by an E3 ubiquitin ligase from Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus [J]. Biochem Soc Trans, 2008, 36(Pt 3): 459-463.

[7] Mansouri M, Bartee E, Gouveia K, Hovey Nerenberg BT, Barrett J, Thomas L, Thomas G, McFadden G, Früh K. The PHD/LAP-domain protein M153R of myxomavirus is a ubiquitin ligase that induces the rapid internalization and lysosomal destruction of CD4 [J]. J Virol, 2003, 77(2): 1427-1440.

[8] Boname JM, Stevenson PG. MHC class I ubiquitination by a viral PHD/LAP finger protein [J]. Immunity, 2001, 15(4): 627-636.

[9] Coscoy L, Sanchez DJ, Ganem D. A novel class of herpesvirus-encoded membrane-bound E3 ubiquitin ligases regulates endocytosis of proteins involved in immune recognition [J]. J Cell Biol, 2001, 155(7): 1265-1273.

[10] Kummer M, Turza NM, Muhl-Zurbes P, Lechmann M, Boutell C, Coffin RS, Everett RD, Steinkasserer A, Prechtel AT. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome [J]. J Virol, 2007, 81(12):6326-6338.

[11] Beaudenon S, Huibreqtse JM. HPV E6, E6AP and cervical cancer [J]. BMC Biochem, 2008, 9(Suppl 1): S4.

[12] Lee HR, Toth Z, Shin YC, Lee JS, Chang H, Gu W, Oh TK, Kim MH, Jung JU. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus viral interferon regulatory factor 4 targets MDM2 to deregulate the p53 tumor suppressor pathway [J]. J Virol, 2009, 83(13): 6739-6747.

[13] Green MC, Monser KP, Clem RJ. Ubiquitin protein ligase activity of the anti-apoptotic baculovirus protein Op-IAP3 [J]. Virus Res, 2004, 105(1): 89-96.

[14] Gammoh N, Gardiol D, Massimi P, Banks L. The Mdm2 ubiquitin ligase enhances transcriptional activity of human papillomavirus E2 [J]. J Virol, 2009, 83(3): 1538-1543.

[15] Brès V, Kiernan RE, Linares LK, Chable-Bessia C, Plechakova O, Tréand C, Emiliani S, Peloponese JM, Jeang KT, Coux O, Scheffner M, Benkirane M. A non-proteolytic role for ubiquitin in Tat-mediated transactivation of the HIV-1 promoter [J]. Nat Cell Biol, 2003, 5(8): 754-761.

[16] Zhadina M, McClure MO, Johnson MC, Bieniasz PD. Ubiquitin-dependent virus particle budding without viral protein ubiquitination [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(50): 20031-200366.

[17] Chung HY, Morita E, von Schwedler U, Müller B, Krüusslich HG, Sundquist WI. NEDD4L overexpression rescues the release and infectivity of human immunodeficiency virus type 1 constructs lacking PTAP and YPXL late domains [J]. J Virol, 2008, 82(10): 4884-4897.

[18] Wang C, Chen T, Zhang J, Yang M, Li N, Xu X, Cao X. The E3 ubiquitin ligase Nrdp1 ‘preferentially’ promotes TLR-mediated production of type I interferon [J]. Nat Immunol, 2009, 10(7): 744-752.

[19] Towers GJ. The control of viral infection by tripartite motif proteins and cyclophilin A [J]. Retrovirology, 2007,4: 40.

[20] Eldin P, Papon L, Oteiza A, Brocchi E, Lawson TG, Mechti N. TRIM22 E3 ubiquitin ligase activity is required to mediate antiviral activity against encephalomyocarditis virus [J].J Gen Virol, 2009, 90(Pt 3): 536-545.