鄧新榮，杜 進(jìn)，羅志福

1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京 102413；2.中國同位素有限公司，北京 100045

采用生物素和親和素系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤預(yù)定位放射免疫顯像及治療研究已取得令人鼓舞的結(jié)果[1-2]。生物素-親和素預(yù)定位系統(tǒng)具有信號放大作用，能夠大幅度提高腫瘤/非腫瘤的放射性核素的比值，從而明顯提高診斷的靈敏度[3-4]。

親和素(Avidin)是一種糖蛋白，又稱抗生物素蛋白或抗生物素，由4個相同的、含128 個氨基酸的亞基組成，亞基之間通過二硫鍵連接，每個親和素分子可以結(jié)合4個生物素(Biotin)分子[5]。生物素和親和素結(jié)合顯示高度的親和性與特異性(親和力Ka=1015L/mol)，它們一旦結(jié)合后很難分離。但當(dāng)生物素或親和素的活性受到損傷時，其結(jié)合能力會下降[6-7]。

在腫瘤預(yù)定位放射免疫顯像中，先引入親和素化抗體，在體內(nèi)預(yù)先定位于腫瘤，再注入放射性核素標(biāo)記的生物素，由于生物素-親和素的高特異性結(jié)合和標(biāo)記生物素的快速體內(nèi)代謝過程，顯著提高了靶比非靶(T/NT)比值，改善了圖像質(zhì)量，提高了顯像的靈敏度[8-10]。

177Lu具有適宜的物理半衰期(6.7 d)，發(fā)射平均能量為133 keV的β-粒子，在組織中的平均射程為670 μm，適合殺死腫瘤組織；同時發(fā)射能量為113(6.4%)和208(11.0%) keV的γ射線用于顯像，可監(jiān)測和指導(dǎo)治療過程，對患者造成的輻射劑量也較少[3]。177Lu較長的半衰期不但為其生產(chǎn)、產(chǎn)品的QA/QC和對遠(yuǎn)離核素生產(chǎn)地點(diǎn)的供應(yīng)提供了方便，還可以減少多次注射給病人帶來的痛苦。177Lu可以通過反應(yīng)堆輻照生產(chǎn)，其低成本和易得性的特點(diǎn)使其適用于生產(chǎn)放射性藥物[4]。因此，177Lu 是近年來受到廣泛關(guān)注的可用于腫瘤治療的放射性核素。177Lu 標(biāo)記的放射性藥物主要用于治療骨轉(zhuǎn)移癌疼痛和原發(fā)灶癌，其中177Lu-EDTMP(乙二胺四甲撐膦酸)和177Lu-DOTA-TATE(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-奧曲肽衍生物)已經(jīng)進(jìn)入臨床研究[11-12]。

本研究旨在采用177Lu標(biāo)記DTPA-BIS-BIOTIN，優(yōu)化標(biāo)記反應(yīng)條件，并對標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)生物分布進(jìn)行研究，為進(jìn)一步采用177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN進(jìn)行腫瘤預(yù)定位顯像及治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

BP211D型電子天平，德國Sartorius公司，感量為10-5g；AR2000 放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；RM-905A型活度計(jì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院；快速薄層紙層析紙(ITLC-SG)，美國PALL公司；GAMMA C12 γ計(jì)數(shù)器，美國DPC公司。

1.2 主要材料與試劑

177LuCl3溶液，放射性濃度為1 840 GBq/L，北京原子高科股份有限公司。DTPA-BIS-BIOTIN，美國SIGMA公司產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)示于圖1。醋酸鈉，美國SIGMA公司；醋酸、生理鹽水等其它化學(xué)試劑，分析純，北京試劑公司。昆明小白鼠，雄性，18～20 g ，二級，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物部。

圖1 DTPA-BIS-BIOTIN的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structrure of DTPA-BIS-BIOTIN

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的制備

在Eppendorf(EP)管中加入15 μL DTPA-BIS-BIOTIN(1.0 g/L，溶于0.2 mol/L NaOAc-HOAc緩沖溶液，pH=4.5)，加入相同醋酸鹽緩沖溶液125 μL，再加入10 μL177LuCl3(18.4 MBq)，混勻，在80 ℃反應(yīng)8 min，取樣進(jìn)行快速薄層層析法(ITLC)檢測分析。

用上述類似的標(biāo)記方法，在其它條件相同的情況下，分別考察不同pH值(3.0、3.8、4.1、4.3和4.5)對標(biāo)記率的影響，DTPA-BIS-BIOTIN含量分別為5、10、15、20、25 μg時對標(biāo)記率的影響以及不同反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響。

2.2 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的分析

取標(biāo)記液點(diǎn)樣于ITLC濾紙(10 mm×200 mm)上，以生理鹽水為展開劑，上行展開，晾干后用放射性薄層掃描儀掃描，計(jì)算標(biāo)記率或放射化學(xué)純度。

2.3 標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性

將標(biāo)記物(放射化學(xué)純度大于99%)于室溫放置96 h，并于期間不同時間點(diǎn)取樣，使用ITLC法檢測標(biāo)記物的放射化學(xué)純度。

2.4 標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)

取體重為18～20 g的正常昆明小鼠30只，隨機(jī)分成6組(每組5只)，經(jīng)尾靜脈注射100 μL177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN(0.3 MBq) ，分別于注射后0.5、1、3、6、24 h斷頭處死，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g) 。

3 結(jié)果和討論

3.1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的制備和分析

在以生理鹽水為展開體系的ITLC分析方法中，游離的177Lu3+的Rf=0.0～0.1，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的Rf=0.8～0.9，本ITLC分析法可用于測定177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度。

圖2 pH值對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響Fig.2 Effect of pH on labeling yield

3.1.1標(biāo)記反應(yīng)pH值對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響 反應(yīng)體系pH對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響示于圖2。當(dāng)DTPA-BIS-BIOTIN 10 μg，177LuCl318.4 MBq，80 ℃條件下，標(biāo)記反應(yīng)液的pH值分別為3.0、3.8、4.1、4.3和4.5時，反應(yīng)20 min后177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標(biāo)記率分別為72.2%、91.2%、91.1%、92.5%和98.0%。177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標(biāo)記率依賴于反應(yīng)體系的pH值，在pH≈4.5時可獲得較高的標(biāo)記率。

3.1.2DTPA-BIS-BIOTIN濃度對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響 DTPA-BIS-BIOTIN濃度對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響結(jié)果示于圖3。在加入相同量177LuCl3時，DTPA-BIS-BIOTIN質(zhì)量分別為5、10、15、20、25 μg時，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率分別為93.5%、95.9%、98.3%、99.1%、99.9%。在DTPA-BIS-BIOTIN質(zhì)量為20～25 μg時，標(biāo)記率基本不變，可獲得高放射化學(xué)純度的177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN溶液。

圖3 DTPA-BIS-BIOTIN質(zhì)量對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響Fig.3 Effect of mass of DTPA-BIS-BIOTIN on labeling yield

3.1.3反應(yīng)時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響 反應(yīng)時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響示于圖4。在相同量的DTPA-BIS-BIOTIN和177LuCl3條件下，DTPA-BIS-BIOTIN質(zhì)量為25 μg、反應(yīng)溫度為80 ℃時，反應(yīng)時間為10 min時177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標(biāo)記率為98.5%，隨著時間延長到60 min，標(biāo)記率均可達(dá)99.0%以上。

圖4 不同反應(yīng)時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率的影響Fig.4 Effect of reaction time of DTPA-BIS-BIOTIN on labeling yield

3.2 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的體外穩(wěn)定性

標(biāo)記物177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN(放射化學(xué)純度大于99%)具有良好的體外穩(wěn)定性，室溫放置24 h穩(wěn)定，放化純大于99%，放置48 h后放化純?yōu)?9%，放置96 h后，放射化學(xué)純度仍都保持在98%以上。

3.3 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠體內(nèi)的生物分布

177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在正常小鼠體內(nèi)分布列于表1。由表1可以看出，經(jīng)尾靜脈注射后，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠血液中清除迅速，30 min 時血中滯留(0.454±0.115)%ID/g，24 h后幾乎全部代謝。177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在腎中有較高的攝取，30 min 時腎的攝取為(2.470±0.375)%ID/g，提示177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN主要經(jīng)腎臟排泄；但在正常組織如肝、脾等有非特異性攝取，這與文獻(xiàn)報(bào)道153Sm-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠體內(nèi)的代謝情況相似[5]。在注射后24 h脛骨攝取為(0.681±0.164)%ID/g，可能是由于經(jīng)過體內(nèi)的生物素激酶作用后，177Lu被釋放濃集于骨骼組織的緣故。這與177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的體內(nèi)穩(wěn)定性相關(guān)，導(dǎo)致其不穩(wěn)定的途徑主要有2種：一是在血清中蛋白激酶如生物素激酶作用下使放射性核素從DTPA-BIOTIN復(fù)合物上脫落；另一途徑是由于此類放射性核素與雙功能螯合劑結(jié)合穩(wěn)定性高，使雙功能螯合劑與生物素之間的鍵斷裂。對于DTPA-BIS-BIOTIN更傾向標(biāo)記核素從復(fù)合物上脫落[13]，本實(shí)驗(yàn)也得到與文獻(xiàn)中報(bào)道類似的結(jié)果。

表1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在正常小鼠體內(nèi)分布Table 1 Biodistribution of 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN in normal mice

注(Note)：n=5

4 結(jié) 論

在最佳標(biāo)記條件下(DTPA-BIS-BIOTIN 25 μg，標(biāo)記介質(zhì)pH=4.5，80 ℃反應(yīng)20 min)，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標(biāo)記率大于99.0%，室溫下放置96 h，標(biāo)記物體外穩(wěn)定性良好。正常小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在血液中清除快，主要濃集于肝、脾和腎，經(jīng)腎臟排泄。本研究為進(jìn)一步采用177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN進(jìn)行腫瘤預(yù)定位顯像及治療研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝：感謝樊彩云、葉肇云等科研人員的幫助。

[1] Lesch H P, Kaikkonen M U, Pikkarainen J T, et al. Avidin-Biotin Technology in Targeted Therapy[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2010, 7(5): 551-564.

[2] Boerman O C, van Schaijk F G, Oyen W J G, et al. Pretargeted Radioimmunotherapy of Cancer: Progress Step by Step[J]. J Nucl Med, 2003, 44: 400-411.

[3] Stella M, de Nardi P, Paganelli G, et al. Avidin-Biotin System in Radio Immunoguided Surgery for Colorectal Cancer, Advantages and Limits[J]. Dis Colon Rectum, 1994, 37: 335.

[4] Sharkey R M, Karacay H, Cardillo T M, et al. Improving the Delivery of Radionuclides for Imaging and Therapy of Cancer Using Pretargeting Methods[J]. Clin Cancer Res, 2005(11): 7 109s-7 121s.

[5] Goodwin D A, Meares C F. Pretargeted Peptide Imaging and Therapy[J]. Cancer Biother Radio-pharm, 1999, 14: 145-152.

[6] Goldenberg D M. Targeted Therapy of Cancer With Radiolaleled Antibodies[J]. J Nucl Med, 2002, 43: 693-713.

[7] Rosebrough S F, Hartley D F. Biochemical Modification of Streptavidin and Avidin:inVitroandinVivoAnalysis[J]. J Nucl Med, 1996, 37(8): 1 380-1 384.

[8] Meredith R F, Buchsbaum D J. Pretargeted Radioimmunotherapy[J]. Int J Radiation Oncology Biol Phys, 2006, 66: S57-S59.

[9] Graves S S, Dearstyne E, Lin Y, et al. Combination Therapy With Pretarget CC49 Radioimmunotherapy and Gerncitabine Prolongs Tumor Doubling Time in Amurine Xenograftmod Elofcolon Cancermore Effectively Than Either Monotherapy[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(10 Pt 1): 3 712-3 721.

[10] Gasparri A, Moro M, Curnis F, et al. Tumor Pretargeting With Avidin Improves the Therapeutic Index of Biotinylated Tumor Necrosis Factor α in Mouse Model[J]. Cancer Research, 1999, 59: 2 917-2 923.

[11] Liepe K, Runge R, Kotzerke J. The Benefit of Bone-Seeking Radiopharmaceuticals in the Treatment of Metastatic Bone Pain[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 31(1): 60-66.

[12] Ando A, Ando I, Tonami N, et al.177Lu-EDTMP: A Potential Therapeutic Bone Agent[J]. Nucl Med Commun, 1998, 19(6): 587-591.

[13] Hainsworth J, Harrison P, Mather S J. Preparation and Characterization of a DOTA-Lysine-Biotin Conjugate as an Effector Molecule for Pretargeted Radionuclide Therapy[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16: 1 468-1 474.