盛靈慧 趙正宜 王 晶 黃 崢

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京 100013)

維生素(vitamin)又名維他命，是維持人體生命活動(dòng)必需的一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)，也是保持人體健康的重要活性物質(zhì)。維生素在體內(nèi)的含量很少，但在人體生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中卻發(fā)揮著重要的作用。目前，同時(shí)分析多種水溶性維生素的方法多有報(bào)道，主要為非離子對(duì)等度、梯度洗脫液相色譜法等，但在實(shí)際樣品分析中目前已有的方法不能完全滿(mǎn)足分離要求，難以消除基體干擾，使目標(biāo)維生素不能獲得理想的分離度。

筆者采用高效液相色譜法對(duì)復(fù)合維生素的分析方法進(jìn)行了優(yōu)化，考察了前處理過(guò)程中提取液的pH值、提取液的體積、超聲溫度等條件對(duì)于測(cè)量結(jié)果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1200型,配有DAD紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；

恒溫水浴槽： DK-8D型，上海一恒科技有限公司；

超聲波清洗機(jī)：CQ25-12D型，寧波新芝生物科技有限公司；

電子天平：ME235s，d=0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司；

維生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：維生素B1(BW 3600)、維生素B2(BW 3601)、維生素B5(BW 3602)、維生素B6(BW 3220)，自制；

維生素藥片樣品：惠氏維生素銀片、復(fù)合維生素B片，購(gòu)自金象大藥房；

三氟乙酸：99.8%，HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma公司；

己烷磺酸鈉：98%，HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司；

甲醇：HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司；

實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atantis T3柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-15 mmol/L 己烷磺酸鈉和50 μL/L三氟乙酸混合溶液(B)，流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 洗脫程序

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取150 mg復(fù)合維生素樣品于50 mL離心管中，加入45 mL鹽酸水溶液(pH 6.0)震蕩搖勻，隨后將離心管置于30℃水浴中超聲提取30 min，靜置，取上清液過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 水浴溫度

在維生素片劑的測(cè)定過(guò)程中，維生素B2的溶解度很小，通常為了增加維生素B2的測(cè)試準(zhǔn)確度，需要在一定的水浴溫度下進(jìn)行超聲。超聲是一種能量的釋放過(guò)程，在超聲的同時(shí)會(huì)帶來(lái)水溫的增加，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著水溫的變化，維生素片劑中維生素B1的測(cè)定結(jié)果具有顯著性的差異。維生素含量隨溫度的變化曲線如圖1所示。

對(duì)圖1進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著水溫的升高維生素B2的含量有所增加，增加幅度為4.1%，在30℃以后變化趨于平穩(wěn)；而隨著溫度的升高維生素B1的含量急劇下降。綜合比較之后實(shí)驗(yàn)選定30℃作為超聲的初始溫度，在超聲過(guò)程中，確保水浴溫度在30～40℃之間變化，為了增加維生素B2的溶出，實(shí)驗(yàn)中提高了水的體積，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)并參考了Pei Chen等發(fā)表的論文[1，2]確定樣品與水的配比為150 mg/(45 mL)。

圖1 維生素含量-溫度曲線圖

2.2 線性方程和檢出限

采用百萬(wàn)分之一天平精密稱(chēng)取維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6，分別加水溶解配制濃度為0.573、0.400、0.834、0.734 mg/g標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，之后依次稀釋獲得標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的條件下進(jìn)行液相色譜測(cè)試，以色譜峰面積(Y)對(duì)樣品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，4種維生素的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限(S/N>10)如表2所示。

表2 線性方程、線性范圍和檢出限

2.3 回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B4、復(fù)合維生素各0.87、0.50、3.07、1.08、150 mg于50 mL離心管中，加水溶解后，定容至45 mL，30℃水浴超聲30 min，取上清液過(guò)濾，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)試。測(cè)定結(jié)果及平均回收率如表3所示。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 日間穩(wěn)定性試驗(yàn)

維生素樣品的穩(wěn)定性受環(huán)境條件影響較為明顯，為了保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)。因?yàn)檎麄€(gè)分析過(guò)程從樣品的前處理到液相色譜測(cè)試完成不超過(guò)24 h，所以只進(jìn)行了日間穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果列于表4。

表4 日間穩(wěn)定性試驗(yàn) mg/g

從表4測(cè)定結(jié)果可以得出復(fù)合維生素在日間的穩(wěn)定性良好，4種維生素含量在24 h之內(nèi)沒(méi)有發(fā)生顯著性的變化。

2.5 樣品測(cè)試

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中確定的前處理?xiàng)l件和液相色譜條件，對(duì)購(gòu)買(mǎi)的兩種復(fù)合維生素片劑中4種維生素的含量進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。圖2為4種維生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液色譜圖，圖3為惠氏維生素樣品色譜圖。

表5 樣品測(cè)試結(jié)果 mg/g

圖2 4種維生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液色譜圖

圖3 惠氏維生素樣品色譜圖

4種維生素均為水溶性維生素，極性較大，在普通的C18柱上保留較弱，通過(guò)加入離子對(duì)試劑改變了其保留特性，延長(zhǎng)了保留時(shí)間。從譜圖3中可以看到4種目標(biāo)維生素能夠在所選擇的液相色譜條件下得到基線分離，消除了維生素片劑中其它組分的干擾，滿(mǎn)足定量要求。

3 結(jié)語(yǔ)

所建立的液相色譜法具有較強(qiáng)的實(shí)用性，有效地避免了基體干擾等問(wèn)題，測(cè)定過(guò)程簡(jiǎn)單，方法準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好，可用于實(shí)際樣品中維生素含量的檢測(cè)。

[1] Pei Chen， Wayne R Wolf. LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of water-soluble vitamins in multi-vitamin dietary supplements[J]. Anal Bioanal Chem ,2007, 387: 2 441-2 448.

[2] Pei Chen, Mustafa Ozcan, Wayne R Wolf. Contents of selected B vitamins in NIST SRM 3280 multivitamin/multielement tablets by liquid chromatography isotope dilution mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem,2007,389:343-347.