王海林，劉嘉琳，宗園媛，張連峰，秦 川

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021）

阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)，同時(shí)伴有精神行為異常和明顯的社會(huì)生活功能減退。超過(guò)80％的65歲以上的老年人存在晝夜節(jié)律的紊亂［1］，如睡眠障礙，在AD病人中這種晝夜節(jié)律紊亂的比例更高［2］，嚴(yán)重影響著 AD病人的生活質(zhì)量。哺乳動(dòng)物的生命節(jié)律由位于視交叉上核的生物鐘基因調(diào)控，NPAS2作為生物鐘基因的旁系同源類(lèi)似物，在哺乳動(dòng)物的前腦發(fā)揮著類(lèi)似的功能，NPAS2缺陷的小鼠睡眠模式和行為的適應(yīng)能力發(fā)生改變［3］。M icroRNAs（miRNAs）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約18-25 nt小調(diào)節(jié)RNAs，通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)?，F(xiàn)有的研究表明，microRNAs參與多種生理和病理過(guò)程，與AD的發(fā)生也密切相關(guān)［4，5］，但是 m icroRNAs對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用是否會(huì)影響AD病人的生活節(jié)律，目前這方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用芯片和real time PCR的方法在AD模型小鼠中篩選出表達(dá)有差異的 microRNAs，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討microRNA是否在 AD病人的晝夜節(jié)律紊亂中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 m icroRNA芯片

μParafloTM microRNA微陣列基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)和分析由LC Sciences公司提供。miRNA探針序列信息來(lái)自于Sanger m iRbase Release 9.2版本數(shù)據(jù)庫(kù)，每種探針至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理和分析首先是扣除背景，計(jì)算重復(fù)點(diǎn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后通過(guò)LOWESS（locally-weighted regression）過(guò)濾進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于雙色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，將計(jì)算兩種檢測(cè)信號(hào)的比值（log2）和t-test的P值，以P ＜0.01定義顯著差異性表達(dá)。數(shù)據(jù)處理結(jié)果根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用hierarchical clustering、K-means/medians clustering或者ANOVA（analysis of variance）等方法。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

將轉(zhuǎn)APPswe基因和 PSΔE9基因的雙轉(zhuǎn) C57/ BL6小鼠和野生型 C57/BL6小鼠雜交，提取鼠尾DNA，PCR鑒定 APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型，篩選陽(yáng)性小鼠進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和real tim e PCR

利用m irVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion）提取6月齡APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠和同月齡對(duì)照小鼠總RNA，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)濃度。利用 m iScript Reverse Transcription Kit（Qiagen）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。Real-time PCR是利用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen）進(jìn)行的，以U6為內(nèi)參。用delta-delta C（t）的方法和t-test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05定義顯著差異性表達(dá)。

1.4 m ir-106b表達(dá)載體的構(gòu)建

按照 BLOCK-iTTMPol II m iR RNAi Expression Vector Kit（invitrogen）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：首先合成 mir-106b的 Top strand oligo（TGCTGTAAA GTGCTGACAGTGCAGATGTTTTGGCCACTGACTGAC ATCTGCACTCAGCACTTTA）和 bottom strand oligo （CCTGTAAAGTGCTGAGTGCAGATGTCAGTCAGTGG CCAAAACATCTGCACTGTCAGCACTTTAC），然后將二者退火結(jié)合生成ds oligo，在T4 DNA連接酶的作用下，將ds olig與pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體進(jìn)行連接，把連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，將菌液涂布在 LB培養(yǎng)板上（含50μg/m L壯觀霉素），37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆，進(jìn)行搖菌測(cè)序。陰性對(duì)照質(zhì)粒由試劑盒提供。

1.5 m ir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定

SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中添加10％熱滅活的胎牛血清和100 U/m L青鏈霉素，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種到24孔板，換成無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2 000（Invitrogen）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后6 h將24孔板中的培養(yǎng)基換成全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后第2天將24孔板的細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)，按1：10傳到60 cm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加2 μg/m L的Blasticidin進(jìn)行篩選。此后，每隔3 d換1次含2μg/m L的 Blasticidin的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2周，然后在熒光顯微鏡下挑選帶GFP的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。構(gòu)建成功后，提取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)成 cDNA后，用 real-time PCR檢測(cè) m ir-106b的表達(dá)，鑒定mir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建是否成功。

1.6 m ir-106b靶基因的預(yù)測(cè)

用Targetsan、Pictar、miRanda等 microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，對(duì)mir-106b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 W estern b lot

從穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中提取總蛋白，蛋白上樣量為70 μg，利用10％的SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，然后將其轉(zhuǎn)移至NC膜上，室溫下用TBST配制的5％牛奶封閉1 h，與兔多抗NPAS2抗體（abcam）進(jìn)行雜交，室溫下孵育2 h，用TBST洗膜3次，與HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG和 β-actin進(jìn)行雜交，室溫下孵育 1h，用TBST洗膜3次，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)

根據(jù) Targetsan、Pictar、m iRanda等靶基因預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)mir-106b與NPAS2 3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增NPAS2的3’UTR（包含與m ir-106b的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)并帶Xho I和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pMDTM18-T載體，命名為 TNPAS2-3’UTR。突變預(yù)測(cè)與 mir-106b結(jié)合位點(diǎn)的堿基，構(gòu)建突變的 pMDTM18-T載體.根據(jù) Targetsan的預(yù)測(cè)，NPAS2與 m ir-106b的結(jié)合位點(diǎn)有兩個(gè)，因此我們分別構(gòu)建了兩個(gè)單突變 pMDTM18-T載體和一個(gè)雙突變pMDTM18-T載體分別命名為T(mén)-NPAS2-3’UTR-M1，T-NPAS2-3’UTR-M2，T-NPAS2-3’UTR-2M。psiCHECKTM-2載體（Promega）含有兩種熒光素酶：螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶。將所構(gòu)建的T-NPAS2-3’UTR、T-NPAS2-3’UTR-M1、T-NPAS2-3’ UTR-M2、T-NPAS2-3’ UTR-2M 載 體 與psiCHECKTM-2載體進(jìn)行Xho I和Not I雙酶切實(shí)驗(yàn)，將野生型或者含有突變位點(diǎn)的NPAS2的3’UTR克隆至psiCHECKTM-2載體的海腎熒光素酶開(kāi)放讀碼框架的下游，構(gòu)建含 NPAS2-3’UTR及突變的NPAS2-3’UTR的熒光素酶報(bào)告載體，分別命名為PNPAS2-3’UTR、P-NPAS2-3’UTR-M1、P-NPAS2-3’UTR-M2、P-NPAS2-3’UTR-2M。將所構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體與 mir-106b表達(dá)載體或者陰性對(duì)照載體在HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h，用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒（Promega）及熒光素酶活性檢測(cè)儀分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，并將海腎熒光素酶的活性用螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較熒光強(qiáng)度的變化。

2 結(jié)果

2.1 芯片結(jié)果和real tim e PCR驗(yàn)證的結(jié)果

芯片結(jié)果顯示：與野生型C57BL/6J小鼠相比，6月齡APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中mir-106b表達(dá)水平明顯降低。由于芯片結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性，我們用real—time PCR的方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，選取6月齡APPswe/PSΔE9小鼠6只（雌雄各半）和同月齡的野生型C57BL/6J小鼠6只（雌雄各半），每只重復(fù)3次，經(jīng)t檢驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P=0.03），采用delta-delta C（t）的方法計(jì)算其比值為1.46，與野生型 C57BL/6J小鼠相比，6月齡APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中m ir-106b的表達(dá)水平升高。6月齡小鼠腦組織中 mir-106b表達(dá)情況的real time PCR結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定結(jié)果。

我們構(gòu)建的mir-106 b表達(dá)載體和試劑盒里提供的陰性對(duì)照質(zhì)粒均含有綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，能夠表達(dá)GFP，，因此我們可以通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)觀察所構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的情況。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功后，可見(jiàn)80％以上的細(xì)胞均表達(dá)GFP（圖2，見(jiàn)彩插1）。

Real time PCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞m ir-106b的表達(dá)，共檢測(cè)了6個(gè)m ir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克?。麨閙 ir-106b-1、2、3、4、5、6）。用delta-delta C（t）的方法進(jìn)行計(jì)算，我們發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，m ir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的m ir-106b的表達(dá)升高2～5倍，說(shuō)明我們的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建是成功的，real-time PCR的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 6月齡小鼠mir-106b表達(dá)情況的real time PCR結(jié)果Fig.1 The expression level of mir-106b in six-month old mice detected by real-time PCR注：“*”：P＜0.05。 note：“*”：P＜0.05.

圖3 mir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系real time PCR鑒定結(jié)果Fig.3 The real-time PCR Results of mir-106b stable transfection cell lines

2.3 W estern b lot結(jié)果

用提取陰性對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和 mir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行 western blot檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，在m ir-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中，NPAS2表達(dá)水平明顯降低（圖4）。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光素酶活性檢測(cè)儀分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，并且用螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性對(duì)海腎熒光素酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可見(jiàn)與陰性對(duì)照相比，P-NPAS2-3’UTR與 mir-106b共轉(zhuǎn)染，海腎熒光素酶的活性下降。熒光素酶報(bào)告載體的NPAS2-3’UTR突變后，與mir-106b共轉(zhuǎn)染其海腎熒光素酶的活性升高；并且熒光素酶報(bào)告載體的NPAS2-3’UTR雙突變與mir-106b共轉(zhuǎn)染，海腎熒光素酶/螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性較單突變更高（圖5）。

3 討論

圖4 NPAS2的Western blot檢測(cè)結(jié)果Note：1：Stable transfection cell line generated with negative control plasm id；2：Stable transfection cell line generated with mir-106bFig.4 The results of Western blot analysis of NPAS2

圖5 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The results of dual-luciferase reporter assay

我們用real-time PCR對(duì)microRNA芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在AD雙轉(zhuǎn)小鼠模型腦組織中m ir-106b的表達(dá)升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hébert等［6］的研究發(fā)現(xiàn) mir-106b的表達(dá)在AD病人的腦組織中有改變，可能通過(guò)調(diào)控淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）的表達(dá)參與AD的發(fā)病。這些研究表明mir-106b可能在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

NPAS2是一種主要在哺乳動(dòng)物前腦表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，與 BMAL1結(jié)合成異二聚體，激活內(nèi)源性Per1、Per2和Cry1基因，從而在哺乳動(dòng)物腦中發(fā)揮分子鐘的功能［7］。我們的研究發(fā)現(xiàn) mir-106b可以調(diào)控NPAS2的表達(dá)：（1）在SH-SY5Y的mir-106b的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，m ir-106b的表達(dá)升高的同時(shí)，NPAS2的表達(dá)下降。（2）雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，mir-106b與 P-NPAS2-3’UTR共轉(zhuǎn)染與對(duì)照質(zhì)粒與P-NPAS2-3’UTR共轉(zhuǎn)染相比，海腎熒光素酶/螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性明顯降低。microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件 Targetsans和 Pictar均預(yù)測(cè) m ir-106b與NPAS2的3’UTR有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)這2個(gè)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)熒光素酶報(bào)告載體的NPAS2-3’UTR突變后與mir-106b共轉(zhuǎn)染，其海腎熒光素酶/螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性單突變較未突變的升高，雙突變的最高。證實(shí)mir-106b通過(guò)與NPAS2-3’UTR的這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合來(lái)發(fā)揮其翻譯抑制作用，對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變能夠使 mir-106b喪失與NPAS2的 3’UTR的結(jié)合功能而無(wú)法發(fā)揮其對(duì)NPAS2的翻譯抑制作用。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)PNPAS2-3’UTR-2M 與 m ir-106b的共轉(zhuǎn)染較 PNPAS2-3’UTR與陰性對(duì)照質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶/螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性升高，理論上講兩者均不存在轉(zhuǎn)染 mir-106b的抑制作用。之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，我們分析可能是因?yàn)?m icroRNA在許多組織和細(xì)胞廣泛表達(dá)，轉(zhuǎn)染所用的HEK-293T細(xì)胞存在的內(nèi)源性的m icroRNA干擾的影響。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)microRNAs參與AD的發(fā)生發(fā)展［8］，干擾 microRNAs的表達(dá)可能為 AD的治療提供一種新的思路和方法［9］。由于AD病人經(jīng)常表現(xiàn)出較正常的老年人更為嚴(yán)重的晝夜節(jié)律紊亂，因此我們的研究表明 mir-106b可能通過(guò)調(diào)控生物鐘基因NPAS2的表達(dá)參與調(diào)控AD病人的生活節(jié)律，干擾mir-106b的表達(dá)可能有助于改善AD病人的這種紊亂，提高其生活質(zhì)量。

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