周 鈺，黎曉紅，袁雪萍，段亞菊，湯舒玲，羅 詠，王 簡

0 引 言

類皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)惡性程度高，腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等與CSCC發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，分子靶向治療成為治療CSCC的潛在治療方式[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類單鏈非編碼RNA，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[3]。據(jù)報(bào)道，circRNA在CSCC中表達(dá)異常，并可能作為CSCC治療的潛在靶點(diǎn)[4]。circ_0091581是一種在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的circRNA，對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，并可抑制細(xì)胞凋亡[5]。但circ_0091581與CSCC相關(guān)研究報(bào)道相對較少。Circular RNA Interactome預(yù)測顯示circ_0091581與miR-136存在結(jié)合位點(diǎn)。研究表明miR-136-5p在CSCC中表達(dá)下調(diào)[6]。因此，本研究主要探討circ_0091581是否可通過靶向調(diào)控miR-136而調(diào)節(jié)CSCC細(xì)胞生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料收集2019年10月至2020年2月本院收治的39份CSCC患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，保存于-80℃冰箱。所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷確診為CSCC。

1.1.2試劑人CSCC細(xì)胞SCL-1購自美國ATCC；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；si-NC、si-circ_0091581、miR-136 mimics、miR-NC、anti-miR-136、anti-miR-NC購自廣州銳博生物；甲基噻唑基四唑(MTT)、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室購自北京Solarbio。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組于6孔板接種1×105個(gè)SCL-1細(xì)胞。參照美國Thermo Fisher公司的Lipofectamine2000說明書，將si-NC、si-circ_0091581、miR-NC、miR-136 mimics、si-circ_0091581與anti-miR-NC(共轉(zhuǎn)染)、si-circ_0091581與anti-miR-136(共轉(zhuǎn)染)分別轉(zhuǎn)染至融合至70%的SCL-1細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-circ_0091581組、miR-NC組、miR-136組、si-circ_0091581+anti-miR-NC組、si-circ_0091581+anti-miR-136組。

1.2.2qRT-PCR檢測基因的表達(dá)水平CSCC組織、癌旁組織與各組SCL-1細(xì)胞的總RNA通過Trizol試劑提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過SYBR Green試劑盒行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測circ_0091581、miR-136相對表達(dá)量。

1.2.3甲基噻唑基四唑(MTT)檢測細(xì)胞增殖于96孔板中接種各組SCL-1細(xì)胞(3×103個(gè))，用MTT溶液(20 μL/孔)與SCL-1細(xì)胞反應(yīng)4 h，以DMSO(150 μL/孔)振蕩孵育5 min終止反應(yīng)，應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取SCL-1細(xì)胞吸光度(A)值，波長490 nm。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)各組SCL-1細(xì)胞接種于6孔板(500個(gè)/孔)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d棄培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌，500 μL甲醇固定SCL-1細(xì)胞20 min，400 μL 1%結(jié)晶紫染色液染色SCL-1細(xì)胞15 min，觀察克隆形成數(shù)。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移取各組SCL-1細(xì)胞接種于上室(1×105個(gè)/孔)，將600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加至下室，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，遷移的細(xì)胞固定后用1%結(jié)晶紫染色，10 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收集各組SCL-1細(xì)胞參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明，重懸于500 μL結(jié)合緩沖液，之后與Annexin V-FITC和PI暗室反應(yīng)10 min，于FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測circ_0091581與miR-136的靶向關(guān)系用Lipofectamine2000在SCL-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0091581與miR-NC或miR-136 mimics、以及共轉(zhuǎn)染MUT-circ_0091581與miR-NC或miR-136 mimics。轉(zhuǎn)染48 h后雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)測量SCL-1細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 circ_0091581和miR-136在CSCC組織中的表達(dá)circ_0091581在CSCC組織中的表達(dá)量(2.45±0.37)較癌旁組織(0.93±0.16)增多(P<0.05)，miR-136在CSCC組織中表達(dá)量(0.43±0.06)較癌旁組織(0.99±0.11)降低(P<0.05)。

2.2下調(diào)circ_0091581對SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響與si-NC組比較，si-circ_0091581組miR-136的表達(dá)量和細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，circ_0091581表達(dá)量、克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，見圖1，表1。

a：下調(diào)circ_0091581處理后SCL-1凋亡的檢測；b：下調(diào)circ_0091581處理后SCL-1遷移的檢測

表 1 下調(diào)circ_0091581抑制SCL-1增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡

2.3circ_0091581和miR-136靶向關(guān)系circ_0091581與miR-136存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶結(jié)果顯示，與miR-NC和WT-circ_0091581共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(1.02±0.11)相比，miR-136和WT-circ_0091581共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(0.38±0.03)顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-circ_0091581共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性相比，miR-136和MUT-circ_0091581共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(0.98±0.08)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明circ_0091581可靶向結(jié)合miR-136。

2.4miR-136對SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響miR-136組細(xì)胞增殖抑制率高于miR-NC組(P<0.05)，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)少于miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組(P<0.05)，見圖3，表2。

2.5抑制miR-136對下調(diào)circ_0091581處理的SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響si-circ_0091581+anti-miR-136組細(xì)胞增殖抑制率比si-circ_0091581+anti-miR-NC組降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)和遷移數(shù)比si-circ_0091581+anti-miR-NC組增多(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率比si-circ_0091581+anti-miR-NC組降低(P<0.05)，見圖4，表3。

圖 2 circ_0091581和miR-136的互補(bǔ)序列

a：miR-1361處理后SCL-1凋亡的檢測；b：miR-136處理后SCL-1遷移的檢測

表 2 miR-136抑制SCL-1增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡

表 3 抑制miR-136可逆轉(zhuǎn)下調(diào)circ_0091581對SCL-1增殖、凋亡、遷移的作用

3 討 論

circRNA通過與miRNA結(jié)合而抑制靶基因表達(dá)發(fā)揮作用[7]，并參與CSCC發(fā)生及發(fā)展過程，還可能作為CSCC診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)記物及治療的潛在靶點(diǎn)[8-11]。

circ_0091581在膠質(zhì)瘤[12]、肝細(xì)胞癌[13]中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究數(shù)據(jù)表明，circ_0091581在CSCC組織中高表達(dá)，暗示circ_0091581在CSCC發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮癌基因作用。本研究隨后利用si-circ_0091581干擾其在CSCC細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾circ_0091581后，CSCC細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移被抑制減弱，細(xì)胞凋亡被促進(jìn)。

本研究初步證實(shí)circ_0091581可吸附miR-136，并可充當(dāng)miR-136的海綿分子。研究表明miR-136在黑素瘤[14]、乳腺癌[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]、胃癌[17]中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可減弱細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，干擾circ_0091581表達(dá)可促進(jìn)miR-136表達(dá)，circ_0091581可通過靶向調(diào)控miR-136的表達(dá)而促進(jìn)CSCC細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移進(jìn)而參與CSCC發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，CSCC組織中circ_0091581表達(dá)上調(diào)，miR-136表達(dá)下調(diào)，circ_0091581可通過充當(dāng)miR-136的海綿分子而調(diào)節(jié)CSCC細(xì)胞生物學(xué)行為，包括細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及凋亡，還可為CSCC的治療提供潛在靶點(diǎn)。但circ_0091581是否可通過靶向調(diào)控其他miRNA而參與CSCC發(fā)生及發(fā)展過程尚需進(jìn)一步探究。