陳春燕，魏 娟，蔣 康，劉 炯，萬(wàn)海軍，康 穎，馮曉玥，姜 瓊，廖婉玉，蔣銘佐，劉 雨，汪芳裕

0 引 言

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是一種常染色體顯性遺傳性疾病，屬于遺傳性結(jié)直腸癌綜合征的一種，發(fā)病率約為1/7000～1/30000[1]。典型臨床表現(xiàn)是結(jié)直腸數(shù)百到數(shù)千枚腺瘤性息肉。結(jié)直腸腺瘤性息肉在童年和青春期開始出現(xiàn)，15歲時(shí)大約50%的FAP患者有結(jié)直腸腺瘤，35歲時(shí)這一比例增加到95%，結(jié)直腸癌的終生風(fēng)險(xiǎn)幾乎是100%，未經(jīng)治療，最終在40歲時(shí)進(jìn)展為結(jié)直腸癌，且70%～80%的腫瘤發(fā)生在左半結(jié)腸[2]。常合并有其他腸內(nèi)及腸外表現(xiàn)，例如胃底腺息肉、十二指腸息肉、先天性視網(wǎng)膜色素上皮肥大、纖維瘤、纖維瘤病、鼻血管纖維瘤、甲狀腺癌、肝母細(xì)胞瘤、腦瘤和胰膽腫瘤[3- 4]。這些患者也可能出現(xiàn)十二指腸腺瘤，與整體人群相比，發(fā)生十二指腸腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了300倍[5]。

腺瘤性息肉病基因APC胚系突變是FAP的主要致病原因。常見的APC基因胚系突變形式為編碼序列的移碼突變、無(wú)義突變、剪接位點(diǎn)異常、錯(cuò)義突變以及大片段的缺失，導(dǎo)致產(chǎn)生截短的或突變的APC蛋白[6-7]。有研究顯示臨床表現(xiàn)輕重與突變位點(diǎn)具有一定的相關(guān)性[8]。本研究旨在對(duì)3個(gè)家系FAP患者的突變類型進(jìn)行篩查，指導(dǎo)臨床。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年1月至2021年12月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院院消化科住院治療的3個(gè)FAP家系。先證者因腹痛、腹瀉、便血等癥狀就診，25-38歲，男1例，女2例。其中2例癌變，腸外表現(xiàn)為：胃、十二指腸多發(fā)腺瘤、胃底腺息肉；十二指腸乳頭腺瘤。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《遺傳學(xué)結(jié)直腸癌臨床診治和家系管理中國(guó)專家共識(shí)》，F(xiàn)AP診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸內(nèi)彌漫性息肉數(shù)量≥100個(gè)或者腺瘤性息肉數(shù)量<100個(gè)伴有家族史或者先天性視網(wǎng)膜色素肥厚，均經(jīng)腸鏡及病理診斷明確。具體臨床資料及家系圖譜見圖1。先證者確診后對(duì)其進(jìn)行家系調(diào)查，采集先證者及家系成員的外周靜脈血，EDTA抗凝，-20 ℃保存。本研究獲得東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2022DZGZR-097)，患者均簽署知情同意書。

■：男；●：女

1.2方法

1.2.1 提取外周血DNA采用QIAamp DNA Tissue Mini Kit(QIAGEN公司，USA)試劑盒，按照說(shuō)明書分別提取外周血DNA，-20℃保存。

1.2.2二代測(cè)序取先證者外周血DNA3～5 μg，將其打斷并擴(kuò)增，建立全基因組文庫(kù)，利用液相捕獲試劑盒與基因組文庫(kù)混合，捕獲目標(biāo)基因片段至探針，進(jìn)而通過(guò)生物素和streptavidin的磁珠結(jié)合被吸附到磁珠上；通過(guò)洗脫處理將非目標(biāo)區(qū)域DNA片段洗掉，從而富集目標(biāo)基因片段，而后利用HiSeq2000高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析。

1.2.3Sanger測(cè)序先證者外周血二代測(cè)序檢測(cè)到的突變位點(diǎn)，對(duì)先證者及家系成員外周血DNA均對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增，ABI 3130XL測(cè)序儀雙向測(cè)序后用Chromas軟件分析測(cè)序數(shù)據(jù)尋找變異位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

家系1先證者及受累成員均檢測(cè)到APC基因第14外顯子c.1945C>T 雜合變異，第1945 號(hào)核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶,編碼的氨基酸由谷氨酰胺變成了一個(gè)終止密碼，翻譯提前停止從而形成截短的APC蛋白。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)到其與FAP相關(guān)。家系中未受累者未檢測(cè)到該位點(diǎn)突變。家系2先證者及受累成員APC基因第15外顯子3129_3130delAC雜合變異，兩個(gè)堿基的缺失會(huì)導(dǎo)致移碼突變，家族中未受累者未檢測(cè)到該突變。家系3先證者及受累成員的APC基因位于第10外顯子c.1363C>T雜合變異，第1363位核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導(dǎo)致455位的密碼子由編碼谷氨酰胺的變?yōu)閁AG，形成一個(gè)終止密碼p.Q455X(無(wú)義突變)，其余正常家系成員未見此突變位點(diǎn)。見圖2。

圖 2 3個(gè)FAP家系先證者APC測(cè)序圖

3 討 論

結(jié)腸癌是男性第三大腫瘤、女性第二常見腫瘤，約70%結(jié)腸癌都是散發(fā)病例。家族易感性病例占10%～30%，而其中5%～7%是遺傳性疾病[9]，約1%的結(jié)直腸癌病例是FAP患者。常見的遺傳性結(jié)直腸癌家族性腺瘤性息肉病有三種表型，分別是經(jīng)典型FAP，衰減型FAP以及常染色體隱性遺傳型息肉病。典型FAP特點(diǎn)是青春期開始發(fā)病，結(jié)直腸成百上千枚枚腺瘤型息肉，隨著時(shí)間進(jìn)展，息肉數(shù)量和大小也逐漸增多增大病最終發(fā)展為結(jié)腸癌，癥狀常常在40歲前出現(xiàn)并與腫瘤發(fā)展有關(guān)。衰減型FAP則侵襲性較經(jīng)典型低，結(jié)直腸息肉數(shù)量較少，一般不超過(guò)100枚，并且癌變率也較低，如果左半結(jié)腸息肉未曾治療，結(jié)直腸癌常常發(fā)生于50或60歲。APC基因的雜合性胚系突變是FAP的發(fā)病原因，約80～95%的FAP患者外周血檢測(cè)到APC基因的突變[10]。

APC是一種抑癌基因，位于人類常染色體5q21-22，全長(zhǎng)108kb，包含15個(gè)外顯子，編碼的蛋白由2843氨基酸殘基組成。第15號(hào)外顯子全長(zhǎng)6571bp，占編碼區(qū)77%，是已知人類基因組中最大的外顯子，也是突變發(fā)生最多的外顯子[11]。APC蛋白在上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包含多個(gè)功能域，與β連環(huán)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物并使其降解，在細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞遷移及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。功能缺失的截短APC蛋白影響β連環(huán)蛋白降解，使其在細(xì)胞質(zhì)大量堆積，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Wnt通路下游靶基因(如C-MYC, cyclin D、ephrins、caspase)，從而影響細(xì)胞的遷移、粘附、激活與轉(zhuǎn)錄、凋亡，從而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[12]。

目前已發(fā)現(xiàn)3000余種APC基因胚系突變類型，約15-20%的FAP患者被檢測(cè)到新的突變，最常見的突變方式是堿基的替換和小的堿基缺失，分別占36%和43%。基因型和表型研究顯示，結(jié)腸癌患者中約60%的突變位點(diǎn)集中在APC的中央?yún)^(qū)域(1284-1580),被稱為突變集群區(qū)域(MCR),該區(qū)域突變導(dǎo)致APC蛋白截?cái)?，缺乏所有靶蛋白的結(jié)合區(qū)除了一個(gè)或兩個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的β連環(huán)蛋白結(jié)合位點(diǎn)[13]。密碼子1061和1309是APC生殖系突變的兩個(gè)熱點(diǎn)，而體細(xì)胞突變熱點(diǎn)為密碼子1309和1450[14]，MCR突變的患者發(fā)病年齡更早[15]。APC基因型與表型的相關(guān)研究可以幫助提高診斷及隨訪。基因檢測(cè)是有利的，因?yàn)锳PC基因的一些突變可能與遺傳異質(zhì)性和疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[16]。FAP基因型和表型分析表明大于5000枚息肉的息肉病患者APC突變常發(fā)生在密碼子1250和1464。位于外顯子15的密碼子1104、1309突變者發(fā)病年齡更早并且表型更嚴(yán)重,結(jié)腸癌變年齡更早并且易合并甲狀腺腫瘤[17]。相反，腺瘤少于100枚的AFAP患者，突變位點(diǎn)常位于5′或3′端或者外顯子9的剪接位點(diǎn)[18]。

本研究的家系1先證者33歲時(shí)因結(jié)腸癌接受手術(shù)治療，胃及十二指腸多發(fā)腺瘤多次行內(nèi)鏡下治療，基因檢測(cè)顯示的APC突變位點(diǎn)為位于外顯子14的無(wú)義突變，提前產(chǎn)生了終止密碼子，其父母均未檢測(cè)到該突變，其子攜帶該突變，經(jīng)建議后行結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃及結(jié)直腸多發(fā)腺瘤性息肉，目前規(guī)律行內(nèi)鏡下治療。家系2患者檢測(cè)到APC基因的3129、3130位點(diǎn)堿基缺失，導(dǎo)致移碼突變，兩種突變均會(huì)導(dǎo)致截短的APC蛋白最終影響APC功能。家系2的突變類型均為第一次報(bào)道。家系3的突變?yōu)榈?0外顯子的無(wú)義突變，該突變位點(diǎn)既往CWalon等人報(bào)道過(guò)[21]，先證者母親同樣檢測(cè)到該變異，早期因?yàn)檎J(rèn)識(shí)不足未重視，后復(fù)查腸鏡提示結(jié)腸腺瘤癌變而行手術(shù)治療。家系3及家系1的家系成員的臨床表現(xiàn)均較重且有腸外表現(xiàn)，突變位點(diǎn)均位于15外顯子以外的非突變熱點(diǎn)區(qū)域。臨床上對(duì)于年輕的結(jié)腸多發(fā)腺瘤患者，應(yīng)仔細(xì)詢問(wèn)家族史，基因檢測(cè)可以幫助明確診斷，及時(shí)行相應(yīng)治療降低腫瘤發(fā)病率，并對(duì)家庭成員進(jìn)行篩查，可根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)家庭高危成員盡早完善腸鏡檢查，對(duì)于未攜帶變異的家庭成員可按正常人群篩查。隨著FAP臨床表型和基因型相關(guān)性的進(jìn)一步研究，臨床工作者可以對(duì)更準(zhǔn)確的為患者及家系成員提供診療及篩查意見，并可以用于產(chǎn)前篩查。