樊尚珩綜述，李 均審校

0 引 言

腎纖維化是腎慢性損傷組織異常修復的結(jié)果，也是幾乎所有進行性腎病的最終共同途徑，其基本特征為腎小管上皮細胞持續(xù)受損激活炎癥反應，肌成纖維細胞活化分泌大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積于腎間質(zhì)中致腎小管萎縮及間質(zhì)毛細血管的丟失，最終腎組織結(jié)構的破壞，腎病理性瘢痕組織形成導致腎生物功能不可逆損害[1-2]。其最終結(jié)局終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)，除腎移植及透析等腎替代治療外尚無其他有效的治療措施，患者承受巨大的經(jīng)濟、心理負擔。近年我國慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率、死亡率仍呈上升趨勢，因此延緩甚至停止CKD的進展一直是腎病領域熱點研究課題[3]。

Hippo信號通路自首次發(fā)現(xiàn)以來一直被譽為最核心的控制器官組織生長途徑之一[4]。研究表明Hippo通路關鍵效應因子yes相關蛋白(yes-associated protein,YAP)/帶有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)對腎發(fā)育、細胞再生、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、促進組織修復等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Hippo通路的擾動可導致腎纖維化的發(fā)展。當外界有害因素持續(xù)存在，YAP/TAZ活性持續(xù)上調(diào)，進而通過啟動炎癥反應、誘導促纖維化因子分泌、ECM過度沉積、細胞異常增殖等機制造成腎損傷[5]?；赮AP/TAZ對腎發(fā)展及腎疾病產(chǎn)生的確切影響的相關研究，研究者們通過實驗靶向干預Hippo信號通路效應因子防治腎纖維化的研究也獲得了一定的成果。本文就現(xiàn)有的研究成果綜述YAP/TAZ對腎纖維化產(chǎn)生的影響及新興的治療措施，為今后延緩腎纖維化的臨床應用提供理論支持。

1 Hippo信號通路的結(jié)構

Hippo途徑最初在果蠅中的突變體腫瘤抑制因子的篩選中被發(fā)現(xiàn)，是一條高度進化保守的信號傳導途徑。哺乳動物Hippo通路由3個激酶級聯(lián)組成： 哺乳動物不育20樣激酶1/2(mammalian STE20-like 1/2,MST1/2)，大型腫瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor kinase 1/2,LAST1/2)，YAP/TAZ，其中TEA結(jié)構域家族成員(TEA domain family member,TEAD)是主要的YAP下游轉(zhuǎn)錄因子[6-8]。MST1/2和LAST1/2是該途徑上游信號的核心組成部分, 而YAP、TAZ是Hippo信號通路下游眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子, YAP 包含多個與其他蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構域，例如 TEAD 結(jié)合結(jié)構域、14-3-3 蛋白結(jié)合結(jié)構域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域和PDZ 結(jié)構域[9-10]。

2 YAP/TAZ蛋白的調(diào)控

當Hippo途徑激活時，該途徑主要成分依次發(fā)生磷酸化，磷酸化的MST1能直接磷酸化LAST1/2，活化的LAST1/2磷酸化YAP/TAZ中重要的絲氨酸殘基S127，LAST1/2對S127的磷酸化是一種主要調(diào)節(jié)機制，通過與YAP伴侶蛋白14-3-3相互作用，導致YAP/TAZ滯留于細胞質(zhì)；此外YAP/TAZ可被β-轉(zhuǎn)導蛋白重復序列蛋白泛素化并經(jīng)歷蛋白酶體降解，阻礙YAP由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核；位于細胞質(zhì)中的YAP 不能與核內(nèi) TEAD 結(jié)合，YAP轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，進而細胞增殖和器官生長受到限制。當激酶級聯(lián)被抑制時，去磷酸化的YAP由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)積聚；為誘導下游靶基因的表達，移位至核內(nèi)的YAP本身不與DNA結(jié)合，而與TEAD相互作用形成YAP-TEAD復合體從而誘導靶基因表達，如結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，最終執(zhí)行Hippo通路生物學功能[11-13]。

在癌癥和其他疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Hippo信號途徑的失調(diào)導致細胞核內(nèi)YAP/TAZ增加，YAP/TAZ的核過度積累是其激活的關鍵因素，也是誘導下游目標基因表達所必需的。有關YAP/TAZ的核質(zhì)穿梭可分為依賴磷酸化和非依賴磷酸化途徑；首先是磷酸化依賴途徑：與位點S127磷酸化致YAP/TAZ細胞質(zhì)滯留相反，YAP絲氨酸殘基在位點S128的磷酸化可中斷其與14-3-3蛋白的結(jié)合，促進YAP核積累。此外，酪氨酸激酶對YAP的磷酸化也可導致YAP核滯留及下游靶基因表達。非磷酸化依賴方式調(diào)節(jié)YAP活性方面：賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Set7 可對YAP的賴氨酸494進行單甲基化使YAP細胞質(zhì)滯留，而YAP在K342處的單甲基化會誘導YAP核定位。YAP也可以在絲氨酸109處被 O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶 O-GlcNA ?；瑥亩茐钠渑c上游激酶LATS1的相互作用，阻止其磷酸化并激活其轉(zhuǎn)錄活性。此外，YAP/TAZ 與其他蛋白質(zhì)如AMOT蛋白、Micro-RNA的相互作用以及細胞機械力也可誘導 YAP 的核定位和激活，從而增加 TEAD 轉(zhuǎn)錄活性[10, 13]。見圖1。

圖 1 YAP/TAZ細胞內(nèi)傳導途徑和致腎纖維化機制

3 YAP/TAZ與腎纖維化

3.1 YAP/TAZ介導機械-生化轉(zhuǎn)導研究發(fā)現(xiàn)細胞可通過機械轉(zhuǎn)導系統(tǒng)將微環(huán)境刺激信號，如ECM剛度增加，轉(zhuǎn)化為控制細胞行為等多方面的生化信號，YAP/TAZ正是實現(xiàn)機械-生化信號轉(zhuǎn)變的關鍵樞紐[14]。Hippo 通路可對細胞的生化、物理環(huán)境作出反應。河馬途徑的核心蛋白成分YAP/TAZ作為調(diào)節(jié)器官大小和腫瘤生長的機械傳感器和機械換能器，可感受細胞微環(huán)境機械-物理屬性如ECM硬度、細胞密度和細胞骨架張力等的變化，將機械信號轉(zhuǎn)化為生化信號，影響下游基因表達從而改變細胞形狀和細胞變化方向，促使成纖維細胞向肌成纖維細胞分化[15-16]。此外，YAP/TAZ信號也可以啟動細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[17]。Landolt等[18]通過實驗表明在腎功能正常狀態(tài)下，YAP/TAZ參與傷口愈合和組織再生。在組織損傷刺激病理狀態(tài)下Hippo通路關閉，YAP去磷酸化誘導EMT發(fā)生，從而促進纖維化的發(fā)展。反之，不斷積累的ECM蛋白驅(qū)使腎組織硬度和生物力學應力增加，誘導EMT，激活YAP，活化的YAP上調(diào)I型、III型和IV型膠原在內(nèi)的纖維化蛋白的mRNA水平，加速ECM沉積形成正反饋回路，導致成纖維細胞激活[19]。此外，Szeto等[20]研究表示YAP/TAZ不同的定位可調(diào)節(jié)細胞骨架張力影響腎間質(zhì)硬化。在柔軟、健康的組織里YAP/TAZ定位于細胞質(zhì)，降低細胞骨架張力，減少硬化的發(fā)生；而在損傷的微環(huán)境中，YAP/TAZ進入細胞核并激活轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，加速ECM沉積和器官硬化。

3.2YAP/TAZ與其他致纖維化通路串擾

3.2.1 YAP/TAZ與TGF-β/Smad信號通路TGF-β/Smad信號通路是目前公認致腎纖維化的驅(qū)動因素，其通過導致腎小管內(nèi)皮細胞損傷、凋亡，大量炎癥細胞因子浸潤刺激成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，使ECM合成與降解機制失衡等作用促進腎纖維化[21]。活化的TGF-β與TGF-β受體Ⅱ結(jié)合啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，激活TGF-β受體Ⅰ，從而激活下游信號通路。SEO等[22]研究表明，敲除上游Sav1基因致YAP/TAZ過表達可誘導TGF-β2和TGF-βRII的表達，且YAP/TAZ可與Smad蛋白協(xié)同促進TGF-β信號轉(zhuǎn)導，刺激EMT樣表型變化，促進腎纖維化發(fā)展。Fujii等[23]實驗也證明了Hippo通路與TGF-β/Smad信號通路的聯(lián)系，通路重要效應因子形成YAP-TEAD-Smad3-p300復合物以促進下游CTGF基因表達增加，促進纖維化發(fā)展。此外，抑制YAP基因表達可降低下游致纖維化因子TGF-β和CTGF的表達，顯著延緩腎功能下降。腎小管上皮細胞TGF-β和CTGF的分泌同時也可能是維持YAP持續(xù)激活的機制[24]。

3.2.2YAP/TAZ與NF-κB信號通路NF-κB是炎癥性疾病的重要調(diào)節(jié)因子，是氧化應激反應重要的炎癥因子。當組織持續(xù)受損，Toll樣受體4 (Toll-like receptors, TLR4)與病原/損傷相關分子模式結(jié)合，激活下游 NF-κB 通路并吸引大量炎癥細胞參與炎癥反應的調(diào)節(jié)，上調(diào)炎癥相關基因的表達，誘導炎癥因子、趨化因子及活性氧分泌，最終導致腎損傷和腎纖維化[25-26]。Wang等[27]通過實驗表明，內(nèi)皮細胞受損時YAP核表達激活NF-κB通路，并上調(diào)了巨噬細胞中促炎細胞因子的表達。此外，Hippo 信號通路作為細胞機械信號傳感器，僵硬的基質(zhì)導致MST1/2 和 LATS1/2 失活，激活的YAP/TAZ移至細胞核中調(diào)節(jié)炎癥反應，增強NF-κB靶基因的誘導從而提高炎癥細胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11 和TNF-α的表達。Xu等[28]研究說明在高糖環(huán)境下，特異性敲除腎小管上皮細胞MST1/2基因小鼠模型中，YAP可與NF-κB、TNF-α相互刺激，形成正反饋回路促進疾病發(fā)展。

3.2.3YAP/TAZ與Rho/Rock信號通路Rho/Rock信號通路參與細胞骨架的重排，且參與細胞環(huán)境機械應激調(diào)節(jié)，促進細胞增殖、凋亡，介導炎癥介質(zhì)、促纖維因子分泌、應力纖維的形成，增加ECM的合成引起腎損傷[29]。Rho因子和肌動蛋白細胞骨架可通過機械轉(zhuǎn)導調(diào)控YAP/TAZ。Rho和F-肌動蛋白的細胞骨架是維持YAP/TAZ功能的基礎，作用于LATS上游或LATS的F-肌動蛋白組成的應激纖維介導YAP的磷酸化，表明抑制Rho或肌動蛋白細胞骨架輕微的破壞，均可導致YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄效果急劇下調(diào)和核定位[30]。

3.2.4YAP/TAZ與Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-連環(huán)蛋白信號激活是多種 CKD 的共同特征。Wnt信號通過與膜受體結(jié)合抑制β-catenin的降解，促進Snail1表達參與EMT促進腎纖維化進展[31]。YAP信號的激活可通過增強Wnt/β-catenin的信號以加強EMT標志物如α-SMA、波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1的表達，并降低上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白的mRNA表達使腎間質(zhì)纖維化嚴重程度增加[22]。器官損傷引起的炎癥反應形成纖維化微環(huán)境，趨使巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞和肥大細胞等炎癥細胞浸潤。Feng等[31]報道巨噬細胞是早期炎癥發(fā)展的關鍵細胞。其中巨噬細胞M2主要分泌TGF-β信號、CTGF、血小板衍生因子，激活肌成纖維細胞等促進腎纖維化。Wnt/β-catenin信號通路上調(diào)YAP/TAZ表達加劇成纖維細胞活化和巨噬細胞M2極化促進腎炎癥和纖維化。

4 YAP/TAZ與腎纖維化相關疾病的研究

4.1 原發(fā)性腎小球疾病膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是原發(fā)性腎小球疾病之一，在我國多發(fā)于老年患者，且相較于年輕人，老年患者預后很差。M型磷脂酶A2受體(PLA2R)抗體在MN的敏感性高，是診斷MN的重要指標。有相關臨床研究表明在抗PLA2R抗體相關MN患者中，YAP表達和MN患者腎組織PLA2R表達以及與PLA2R相關MN嚴重程度呈正相關，另外相比于YAP低表達組，YAP高表達組腎功能顯著下降[32]。特發(fā)性膜性腎病(IMN)是病因不明的MN，補體膜攻擊復合物C5b-9介導的足細胞損傷是IMN主要的致病因素。國內(nèi)研究學者實驗提示在IMN患者腎小球中YAP高度表達，C5b-9可激活足細胞YAP信號表達，且沉默YAP表達可顯著改善C5b-9誘導的足細胞損傷、凋亡以延緩IMN的發(fā)展[33]。

局灶節(jié)段性腎小球硬化 (focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是臨床預后較差的常見慢性腎小球疾病，足細胞的凋亡、丟失是FSGS重要發(fā)病機制之一，因此保護足細胞是治療FSGS的關鍵靶點。近年國內(nèi)外研究表明Hippo/YAP通路在FSGS進展中發(fā)揮重要作用，Schwartzman等[34]研究表明YAP的激活可發(fā)揮足細胞凋亡的生理拮抗劑作用以維持腎小球濾過屏障的完整性，減輕蛋白尿和腎小球損傷；而YAP基因敲除則直接導致足細胞耗竭。Zhuang等[35]通過研究表明在FSGS患者和阿霉素誘導的FSGS小鼠模型以及原代足細胞培養(yǎng)的腎樣本中YAP主要在足細胞的細胞質(zhì)中大量表達和積累，阿霉素呈時間相關性誘導足細胞中YAP核排斥，而YAP核排斥則與足細胞凋亡呈正相關。與其他有關維替泊芬(verteporfin，VP)可降低YAP/TAZ水平減輕腎纖維化的研究不同，在FSGS小鼠模型中使用VP可誘導YAP從足細胞核向細胞質(zhì)的易位從而加速FSGS進展，綜上YAP活化及核分布是 FSGS進展重要的內(nèi)源性抗凋亡機制，靶向YAP可能是FSGS治療的潛在療法。除了FSGS，足細胞耗竭還與IgA腎病有關，但Hippo/YAP通路能否通過影響足細胞對IgA腎病發(fā)揮作用仍需未來更多的探索。

4.2糖尿病腎病糖尿病腎病(diabetic nephropathy ,DN)是ESRD基礎上最嚴重的腎疾病之一。因此，探究糖尿病腎病的發(fā)病機制并延緩其進展一直是當代研究熱點。DN進展的特征是足細胞密度降低，Haley等[36]在DN患者中證明了YAP在足細胞應激反應中不可或缺，YAP的細胞質(zhì)易位使細胞骨架重排導致足細胞足突消失、隨后脫離腎小球，且這種變化在Ⅲ、Ⅳ級病例中更為明顯。Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病環(huán)境中EGFR依賴性YAP蛋白上調(diào)，當糖尿病小鼠腎近端小管上皮細胞暴露于高糖環(huán)境中可激活EGFR-PI3K-Akt-CREB信號通路從而介導YAP基因表達、YAP核轉(zhuǎn)位且增加YAP- TEAD結(jié)合，導致TEAD 依賴性促纖維化基因，如CTGF、雙調(diào)蛋白基因表達上調(diào)，形成YAP-TEAD-CTGF通路加劇腎損害；相反，在腎上皮細胞系中沉默EGFR、Akt或CREB的藥理學或基因表達會阻斷高糖誘導的YAP蛋白表達和磷酸化以延緩DN進展。此外，Xu等[28]通過研究表明，在糖尿病腎近端小管上皮細胞中Rho/ROCK信號的激活介導YAP激活，過度產(chǎn)生的ECM使腎間質(zhì)剛度增強，進一步激活Rho/ROCK信號通路，形成高血糖-Rho/ROCK-YAP-ECM-基質(zhì)剛度-Rho/ROCK的惡性循環(huán)，推動糖尿病腎病纖維化的進展[38]。

5 Hippo信號通路靶向治療抗腎纖維化

5.1 Hippo通路抑制劑YAP/TAZ已成為治療慢性腎病的一個有吸引力的靶點。越來越多的實驗研究表明Hippo通路在纖維化及上皮性癌變的分子細胞機制中有著許多共同的特征，提示在纖維化的治療中我們是否可以應用與抗腫瘤中相似的靶向治療[18]。中斷YAP-TEADS結(jié)合是目前新的藥理干預。VP長期以來一直在臨床上通過光動力療法用于治療年齡相關性黃斑變性，也是抗腫瘤的有效光敏劑[39]?；谀壳暗难芯孔C據(jù)：VP可破壞YAP-TEAD復合物，抑制YAP/TAZ活性，因此VP可能被重新定位為一種抗腎纖維化的潛在藥物。Wang等[40]的聯(lián)合實驗研究表明， VP通過上調(diào)14-3-3α來抑制YAP的功能，阻止YAP遷移到細胞核，并通過蛋白酶體靶向降解YAP蛋白。Jin等[41]通過向小鼠腹腔注射VP發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控TGF-β/Smad信號通路、降低Smad磷酸化；降低肌成纖維細胞的活化、增殖和遷移；降低UUO小鼠中YAP/TAZ水平；有效抑制YAP-Tead結(jié)合；Liu等[42]研究表明VP可對UUO誘導的腎間質(zhì)損傷、炎癥反應、細胞外基質(zhì)沉積及纖維化起保護作用。VP也可誘導構象變化，干擾YAP與其他蛋白相互作用的能力傳導下游信號CTGF的表達。此外，Ren等[43]使用G 蛋白偶聯(lián)受體凝血因子II受體樣1拮抗劑可選擇性阻斷內(nèi)皮細胞中YAP的促纖維化活性、減少EMT以減輕腎纖維化。Li等[44]研究發(fā)現(xiàn)對UUO小鼠使用法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)激動劑EDP-305可呈劑量依賴性地減少巨噬細胞浸潤及間質(zhì)纖維化，且降低人腎細胞中TGF-β誘導的YAP核激活，說明抑制YAP可能是FXR激動劑的一種新的抗纖維化機制。更深入地了解河馬通路上游調(diào)節(jié)因子和下游效應因子以及相關抑制劑作用靶點對我們在探索延緩腎纖維化治療方法中至關重要。

5.2其他藥材提取物長久以來中藥通過多靶點、多途徑治療腎纖維化一直具有獨特的優(yōu)勢和應用前景。除以上抑制劑外，使用中藥調(diào)控Hippo通路以抗腎纖維化的研究也獲得了越來越多的關注和實驗證明。目前研究者們已通過實驗證明使用單味中藥提取物如雷公藤甲素[45]、桑枝多糖[46]、姜黃素[47]等以及中藥復方如黃芪三七合劑[48]、蟲草益腎方[49]可抑制Hippo信號通路關鍵因子YAP/TAZ核表達從而延緩腎纖維化發(fā)展。因此，積極開展中藥有效組分及配伍與Hippo通路之間相互作用以及藥物作用于通路靶點的研究,對延緩慢性腎病發(fā)展并指導中醫(yī)藥治療腎纖維化的相關研究具有重要科學意義。

6 結(jié) 語

Hippo信號通路在腎損傷修復中發(fā)揮重要作用，其過度激活可引起細胞增殖、黏附及轉(zhuǎn)移，介導器官大小及腫瘤發(fā)生。近年研究表明Hippo信號通路在腎纖維化中起重要作用。此通路調(diào)控腎纖維化中重要的病理過程--ECM的合成、沉積，且受細胞基質(zhì)硬度的相互作用加劇腎纖維化發(fā)展；與多條公認的致纖維化通路如TGF-β通路、NF-κB信號通路等相互作用；且抑制該通路重要效應因子YAP/TAZ可顯著減輕腎纖維化。盡管已有研究顯示藥物干預Hippo信號通路抗腎纖維化且取得了一定的研究成果，但目前的研究大多限于細胞、動物實驗，并未真正應用于臨床治療中；同時該通路各級效應因子相互作用復雜，應通過更多實驗證明該通路除YAP/TAZ其他因子對腎疾病的影響，且通過進一步實驗了解抑制劑干預潛在靶點之間的關聯(lián)?？傊^續(xù)探索河馬途徑對原發(fā)、繼發(fā)性腎疾病的正常生理機制和致病機制以及對相關靶點干預可為我們在臨床工作中延緩腎纖維化發(fā)展提供新的治療靶標和策略。