任艷軍，張新日

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科，太原 030001）

機(jī)械通氣具有兩面性，使用不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥——呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，VILI的發(fā)生率在機(jī)械通氣患者中高達(dá)15％，其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，涉及面非常廣泛［1］。本實(shí)驗(yàn)試圖通過測(cè)定不同潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織HMGB1mRNA及其蛋白的表達(dá)水平，探討HMGB1與VILI之間的關(guān)系，從而為VILI的基礎(chǔ)研究和臨床防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制備

雄性健康W istar大鼠24只（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：山醫(yī)字第070101），體重310～380 g，隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組：未行機(jī)械通氣；②小潮氣量組：VT=7 m L/kg；③大潮氣量組： VT=30 m L/kg。

25％烏拉坦（4 m L/kg）腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均通過膠管與動(dòng)物人工呼吸機(jī)（DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造）相連接，行機(jī)械通氣。各組大鼠的通氣參數(shù)除潮氣量外，其余均相同，即 I∶E=1∶3，F(xiàn)iO2= 21％，F(xiàn)=60次/min，通氣時(shí)間為150 min。

通氣結(jié)束后切斷腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，切取肺臟，左肺用中性甲醛液灌注固定，常規(guī)石蠟包埋用于普通病理、免疫組化和原位分子雜交檢測(cè)。右肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)（2 m L×4次），留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）。BALF回收量不少于80％，以3 000 r/min離心 10 min，取上清液 -30℃凍存待測(cè)。

1.2 大鼠肺組織HE染色

采用伊紅-蘇木素染色法在光鏡下觀察肺組織和各級(jí)支氣管的損傷情況。

1.3 大鼠 BALF中髓過氧化物酶（M PO）活性測(cè)定

采用髓過氧化物酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定 BALF中MPO活性。測(cè)定方法及操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 肺組織HMGB1免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉素親和-生物素-過氧化酶復(fù)合物（SABC）法對(duì)肺組織細(xì)支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行HMGB1免疫組織化學(xué)染色，具體操作步驟參照試劑盒說明（試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物有限公司）。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶50，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：陽(yáng)性染色為細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400倍光鏡下對(duì)每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野或直徑100～200μm的細(xì)支氣管進(jìn)行觀察。采用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別檢測(cè)每個(gè)視野HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（A），以上述5個(gè)視野的平均值作為該大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.5 肺組織HMGB1m RNA原位雜交檢測(cè)

采用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)肺組織 HMGB1 mRNA表達(dá)，具體操作步驟按試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物有限公司）說明進(jìn)行。陽(yáng)性染色為細(xì)胞胞漿呈棕黃色，檢測(cè)結(jié)果分析判斷方法同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色

HE染色光鏡下觀察，對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)和各級(jí)支氣管上皮完整，肺間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。小潮氣量?jī)H見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但肺間質(zhì)無明顯水腫。大潮氣量組可見彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管斷裂，肺泡腔內(nèi)有出血（圖1～2）。

2.2 大鼠BALF中M PO活性測(cè)定結(jié)果

各組大鼠BALF中MPO活性測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：與對(duì)照組和小潮氣量組比較，大潮氣量組大鼠BALF中MPO活性明顯增高（均P＜0.01），對(duì)照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

MPO活性用酶活力單位表示，即每克組織蛋白在37℃的反應(yīng)體系中使H2O2分解為1μm為一個(gè)活力單位。

2.3 肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

各組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見表1和圖3～5。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和小潮氣量組比較，大潮氣量組肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1表達(dá)明顯增多（均P＜0.01），對(duì)照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA，蛋白的表達(dá)及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA，蛋白的表達(dá)及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

注：與對(duì)照組比較：*P＜0.01；與小潮氣量組比較：#P＜0.01Note：*P ＜0.01，compared with the controe group；#P ＜0.01，compared with the low tidal volume group.

組別Group 例數(shù)n HMGB1 mRNA表達(dá) HMGB1蛋白表達(dá) BALF中MPO活性（U/L）對(duì)照組8 6.94±0.44 6.40±0.47 22.20±5.31小潮氣量組 8 7.27±0.43 6.94±0.57 23.21±6.32大潮氣量組 8 15.70±1.50*# 12.9±0.80*# 51.20±6.01*#

2.4 肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1 m RNA原位雜交檢測(cè)

各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA原位分子雜交測(cè)定結(jié)果見表1和圖6～8（圖1～8見彩插3）。結(jié)果顯示，大潮氣量組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組和小潮氣量組（均P＜0.01），對(duì)照組與小潮氣量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

大量研究表明，炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子在VILI發(fā)病過程中具有重要作用。肺泡上皮受到機(jī)械牽拉后可釋放多種炎癥細(xì)胞因子，如MIP-1α、TNF-α、LI-1β、LI-6及LI-8等，使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)大量募集活化。中性粒細(xì)胞和和巨噬細(xì)胞活化后不但產(chǎn)生大量彈力酶和膠原酶，還可釋放大量過氧化物。這些物質(zhì)可直接或間接破壞肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起肺組織損傷［2］。本研究也證實(shí)了這點(diǎn)，病理可見大潮氣量通氣組大鼠肺組織彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚。Brad ley等［3］研究表明，MPO水平與中性粒細(xì)胞數(shù)之間存在極顯著的相關(guān)性，可作為中性粒細(xì)胞的活性標(biāo)志。本研究顯示，大潮氣量組BALF中MPO活性明顯高于小潮氣量和正常組，表明中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)募集，活化在VLIL中起著重要作用，同時(shí)也說明VLIL中確實(shí)存在炎癥反應(yīng)。

高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的炎癥因子，因其在聚丙酰胺凝膠電泳中具有高遷移率而得名。HMGB1的生物學(xué)活性極為豐富，不但參與細(xì)胞的分化、遷移和再生，還可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［4-5］。Wang等［6］研究發(fā)現(xiàn)給予受試小鼠注射純化的重組 HMGB1（10～50μg/只），2 h內(nèi)即出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥癥狀 ，包括嗜睡、腹瀉等。大劑量（500 μg/只）給予，則5只受試鼠中3只分別在 18、30、36 h死亡 ，用帶有缺陷 HMGB1 cDNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中提純出來的蛋白質(zhì)片段給予對(duì)照組小鼠，則未出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥，證明觀察到的毒性反應(yīng)是HMGB1所特有的。Abraham等［7］發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管給小鼠注入HMGB1后發(fā)現(xiàn)，肺組織局部中性粒細(xì)胞聚集、間質(zhì)水腫，同時(shí)炎癥細(xì)胞因子如 IL-1β、TNF-α、M IP-2等表達(dá)明顯增多，且呈劑量依賴效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可通過內(nèi)分泌和旁分泌形式作用于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，使其表達(dá)一系列炎性介質(zhì)和炎癥因子。這些炎性介質(zhì)和炎癥因子又可進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的釋放，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)逐級(jí)放大［6］。

本研究結(jié)果顯示，大潮氣量組肺組織 HMGB1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和小潮氣量組明顯增高（均P＜0.01），說明HMGB1在VILI的發(fā)病中可能具有重要作用，但其具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，RAGE（receptor for advanced glycation end products）是目前已知的HMGB1的高親和力受體，它是一種跨膜蛋白，能結(jié)合多種配體。HMGB1與RAGE在細(xì)胞表面結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞內(nèi) p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）、NF-κB等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而使細(xì)胞釋放其他因子［8］。已有研究證實(shí)大潮氣量機(jī)械通氣可使局部肺組織炎癥細(xì)胞聚集、活化，并釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，推測(cè)大潮氣量機(jī)械通氣可能直接啟動(dòng)了 HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生HMGB1由于其自身的毒性導(dǎo)致肺損傷，同時(shí)產(chǎn)生的HMGB1參與了其他炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的活化，這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子進(jìn)一步導(dǎo)致HMGB1mRNA及其蛋白的高表達(dá)，從而生成大量?jī)?nèi)源性 HMGB1導(dǎo)致肺組織的進(jìn)一步損傷。盡管研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在膿毒癥中是一種重要的晚期炎癥因子，但HMGB1可能早期就參與了VILI的發(fā)生。對(duì)照組和小潮氣量組上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明小潮氣量機(jī)械通氣對(duì)正常肺組織無明顯影響。

綜上所述，大潮氣量機(jī)械通氣可使肺組織HMGB1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯增高，從而產(chǎn)生大量的HMGB1參與了VILI的發(fā)生，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Tremblay LN，Slutsky AS.Ventilator-induced injury： from barotraumas to biotrauma［J］.Proc Assoc Am Physicians，1998，110：482-488.

［2］ Slustsky AS，Imai Y.Ventilator-induced lung injury，cytokines，PEEP，and mortality：implication for practice and for clinical trials［J］.Intensive Care Med，2003，29（8）：1218-1219.

［3］ Bradley PP，Priebat DA，Christensen RD，et al.Measurement of cutaneous inflammation：estimation of neutrophil content with an enzyme marker［J］.J Invest Dermatol，1982，78：206-209.

［4］ Tenenbaum T，Essmann F，Adam R，et al.Cell death，caspase activation，and HMGB1 realease of porcine choroid plexus epithelial cells during Strepeococcus suis infection in vitro［J］.Brain.Res，2006.1100（1）：1-12.

［5］de Oliveira FM，de Abreu da Silva IC，Rum janek FD，et al.Cloning the genes and DNA binding properties of high mobility group B1（HMGB1）proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum［J］.Gene，2006，377：33-45.

［6］ Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMGB-1 as a latemediator of endotoxin lethality inmice［J］.Science，1999，285（5425）： 248-251.

［7］ Abraham E，Arcaroli J，Carmody A，et al.HMGB-1 as a mediator of acute lung inflammation［J］.J Immunol，2000，165 （6）：2950-2954.

［8］ Lindersson EK，Hojrup P，Gai WP，et al.alpha-synuclein filaments bind the transcriptional regulator HMGB-1［J］.Neuroreport，2004，15（18）：2735-2739.