于雪馨，王常林，孫榮國，楊屹

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院1.小兒內(nèi)科；2.小兒泌尿外科，沈陽 110004）

鼠輸尿管完全梗阻后腎臟病理及足細胞表型改變的研究

于雪馨1，王常林2，孫榮國2，楊屹2

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院1.小兒內(nèi)科；2.小兒泌尿外科，沈陽 110004）

目的 觀察鼠輸尿管完全梗阻后腎臟病理和足細胞表型改變的時序變化，尋找輸尿管梗阻后腎臟發(fā)生不可逆損傷的時相。方法 建立單側(cè)輸尿管完全梗阻動物模型，梗阻后不同時間點取出腎臟，經(jīng)HE染色和免疫熒光雙標方法，觀察腎臟病理及足細胞表型的改變。結(jié)果 大體觀察，梗阻24h后出現(xiàn)腎盂擴張，梗阻3d后出現(xiàn)腎皮質(zhì)變薄。組織學(xué)觀察，梗阻12h后出現(xiàn)一部分近曲小管擴張，小管上皮細胞呈水樣變性腫脹，在梗阻3d后出現(xiàn)大量小管上皮細胞變形腫脹。免疫熒光雙標法，梗阻24h后有少量足細胞、巨噬細胞同時被2種抗體標記，2d后足細胞呈減少趨勢，而巨噬細胞逐漸增多。結(jié)論 輸尿管梗阻后在腎臟病理改變早于腎臟發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的發(fā)生，輸尿管梗阻后24h發(fā)生足細胞表型的改變，與腎臟腎盂出現(xiàn)明顯擴張的時間相近，隨著梗阻時間的延長，腎臟病理改變逐漸加重，足細胞轉(zhuǎn)化逐漸增多。

輸尿管梗阻；足細胞表型；腎臟損傷

輸尿管梗阻所致的腎積水是小兒泌尿外科常見的先天畸形。隨著產(chǎn)前超聲的廣泛應(yīng)用，胎兒及無癥狀新生兒腎積水診斷率大大提高，改變了以往因出現(xiàn)臨床癥狀就診手術(shù)的醫(yī)學(xué)模式。這些無癥狀腎積水何時手術(shù)成為困擾臨床醫(yī)生的一大難題。診斷輸尿管梗阻意味著腎臟會發(fā)生不可逆性損害，在腎臟發(fā)生不可逆損害前解除梗阻，才能挽救腎臟功能。腎臟何時發(fā)生不可逆損傷？是否存在腎臟發(fā)生不可逆損傷的時間點？據(jù)此，我們制作單側(cè)輸尿管完全梗阻的動物模型，在梗阻后不同時間點觀察腎臟大體形態(tài)改變、鏡下病理改變和腎臟足細胞表型改變時序變化。

1 材料與方法

1.1 材料

選用生后2周、2月SD大鼠（其腎臟發(fā)育程度分別相當于人類新生兒及兒童腎臟程度）。本研究在衛(wèi)生部小兒先天畸形重點實驗室完成，使用主要設(shè)備：光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡。羊抗大鼠podocalyxin單克隆抗體。小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體，F(xiàn)ITIC標記兔抗羊IgG，正常非免疫山羊血清，RODAMINE標記羊抗小鼠IgG。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作：生后2周、2月SD大鼠各96只，隨機分為梗阻組和對照組，每組又以梗阻后6h、12h、24h、3d、5d、7d各分為 6組，每組 8只。

實驗組在輸尿管上1/3近腎盂處，用雙線結(jié)扎，中間離斷。對照組，步驟同前，僅游離輸尿管后不結(jié)扎。分別于術(shù)后 6h，12h，24h，3d，5d 和 7d 處死大鼠。取出雙側(cè)腎臟。

1.2.2 病理檢查：測量各組腎臟大小及腎皮質(zhì)厚度后，HE染色。光鏡下觀察腎病理病變。

1.2.3 免疫熒光雙標：一抗為羊抗大鼠podocalyxin單克隆抗體和小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體，抗體滴度為1∶100，二抗為FITIC標記兔抗羊IgG1∶50和RODAMINE標記羊抗小鼠IgG1∶20。

1.2.4 在熒光顯微鏡下，觀察足細胞特異性標記物podocalyxin和巨噬細胞特異性標記物ED-1的免疫熒光雙標結(jié)果。每張切片取5個視野，將數(shù)字化圖像儲存于計算機，計數(shù)每高倍視野下，被紅光和綠光標記的細胞數(shù)，應(yīng)用ImageAnalysis程序進行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計系統(tǒng)進行分析。組間比較采用配對t檢驗，各指標不同時間點的變化趨勢用均數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

未見術(shù)后感染。10只2周齡大鼠術(shù)前狀態(tài)差，不能耐受手術(shù)刺激而死亡，各組缺少樣本均予以補充。余者術(shù)后3d逐漸恢復(fù)正常。梗阻24h后，出現(xiàn)腎盂擴張，隨時間延長，腎盂擴張程度加重，梗阻3d后腎皮質(zhì)逐漸變?。▓D1）。

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

對照組腎臟未見異常，實驗組隨梗阻時間延長，腎小管間質(zhì)損害進行性加重，12h后，近曲小管明顯擴張，管腔擴大，小管上皮細胞呈水樣變性改變；3d后，大量小管上皮細胞變性腫脹，導(dǎo)致管腔狹窄，形狀不規(guī)則（圖2）；7d后，上皮細胞變性腫脹，呈壞死改變，管腔內(nèi)見粉染的蛋白管型形成。

2.3 熒光免疫觀察結(jié)果

對照組術(shù)后各時間點，均見腎小球內(nèi)足細胞被綠色熒光標記，未見細胞同時被兩種抗體標記。實驗組，在梗阻6h和12h腎小球內(nèi)足細胞被綠色熒光標記，未見有細胞同時被兩種抗體標記；在梗阻后24h，有少量細胞同時被兩種抗體標記（圖3）；梗阻后3～7d，同時被兩種抗體標記的細胞逐漸增多（圖4）。但2d后足細胞特異性標記物細胞逐漸減少，巨噬細胞特異性標記細胞逐漸增多。

表1實驗組大鼠每高倍視野下同時被紅色熒光和綠色熒光標記的平均細胞數(shù)Ta b.1Th eme a nn u mb e r o f c e l l sl a b e l e db yb o t hr e da n dg r e e n f l u o r e s c e n c e Group 2W 2month 6h 0.0 0.012h 0.0 0.024h 1.7 1.33d 12.8 12.05d 17.3 16.47d 19.6 19.1

3 討論

在臨床上，隨著超聲的廣泛應(yīng)用，使胎兒及新生兒腎積水的診斷率大大提高，但是目前對于腎積水手術(shù)時機的選擇，仍存在爭議。此外，梗阻性腎病是嬰兒和兒童腎臟衰竭最常見的原因，但是目前對兒童梗阻性腎病的治療尚局限于手術(shù)解除梗阻，而一些學(xué)者對后尿道瓣膜患兒遠期療效的觀察提示，許多患兒解除梗阻后遠期仍存在高血壓、腎功能衰竭等嚴重問題［1］。

我們對腎盂輸尿管梗阻兒童腎臟臨床和病理研究發(fā)現(xiàn)，即使輕度腎積水也有腎臟纖維化的發(fā)生，并且術(shù)后遠期隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，仍然有一些患兒腎臟功能和形態(tài)不能恢復(fù)［2］。

因此，對于這些新生兒腎積水以及梗阻性腎病，目前均需尋找腎臟發(fā)生不可逆損傷的時相，在腎臟發(fā)生不可逆損傷前通過手術(shù)解除梗阻，或者應(yīng)用干預(yù)措施減輕腎臟損害。

在腎臟中，足細胞受損傷后不能有效的增殖和修復(fù)，從而導(dǎo)致足細胞數(shù)量的進行性下降。這種“足細胞減少現(xiàn)象”在慢性腎臟疾病腎小球硬化中起重要作用，而腎小球硬化正是慢性腎衰竭的病理變化基礎(chǔ)［3］。局灶節(jié)段性腎小球硬化的研究表明：足細胞表型的改變及缺失是腎臟發(fā)生不可逆損傷的標志，足細胞在腎臟發(fā)育完成后即不能再生，足細胞從腎小球細胞基底膜脫落使基底膜裸露，并且獲得巨噬細胞的表型，啟動腎臟不可逆性損傷。

在本實驗中，我們通過觀察輸尿管梗阻后腎臟病理改變，以及足細胞表型轉(zhuǎn)化的時序，來確定輸尿管梗阻后腎臟發(fā)生不可逆損傷的時相，旨在為臨床腎積水選擇適宜的手術(shù)時機提供依據(jù)。2周齡和2月齡大鼠腎發(fā)育程度分別對應(yīng)人類新生兒和兒童腎發(fā)育程度。因此，我們通過對這兩個年齡組大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，模擬人類新生兒期和兒童期梗阻性腎病的病理發(fā)生發(fā)展過程。在本實驗中，大體觀察梗阻24h后出現(xiàn)腎盂擴張，3d后出現(xiàn)腎皮質(zhì)變薄。組織學(xué)觀察，梗阻12h后出現(xiàn)一部分近曲小管擴張，小管上皮細胞呈水樣變性腫脹，梗阻3d后出現(xiàn)大量小管上皮細胞變形腫脹、管腔狹窄。我們采用免疫熒光雙標的方法，在梗阻后24h，最先觀察到有少量細胞同時被兩種顏色的熒光標記，表明在這個時間點開始有足細胞向巨噬細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。提示腎臟的不可逆損害發(fā)生在梗阻的早期。并且2周大鼠和2月齡大鼠發(fā)生足細胞表型改變的時間點是一致的，但是在同一梗阻時間點2周大鼠比2月大鼠發(fā)生轉(zhuǎn)化的足細胞多，提示與成年大鼠相比，年幼大鼠足細胞對輸尿管梗阻的耐受力差。隨著輸尿管梗阻時間的延長，同時被兩種熒光標記的細胞逐漸增多，從梗阻1d到7d呈上升趨勢，表達巨噬細胞特異性標記物的細胞也逐漸增多，而足細胞特異性標記物逐漸減少，說明足細胞的損害發(fā)生在梗阻早期，隨梗阻時間的延長，足細胞轉(zhuǎn)化逐漸增多，并且足細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的時間大致與腎盂明顯擴張的時間相同。對于輸尿管梗阻的動物模型研究表明，輸尿管梗阻后腎臟病理改變（包括腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化）要早于腎臟形態(tài)學(xué)的改變（腎盂擴張）［4，5］。我們通過實驗證實了這一觀點，小管上皮細胞首先出現(xiàn)變性壞死，其次為足細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，最后才出現(xiàn)了腎盂擴張等形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

［1］KarmarkarSJ.Long-termresultsofsurgeryforposteriorurethralvalves：a review［J］.Pediatr Surg Int，2001，17（1）：8-10.

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［3］Durvasula RV，Shankland SJ.Podocyte injury and targeting therapy：an update［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens.，2006；15（1）：1-7.

［4］Thornhill BA，Burt LE，Chen C，et al.Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat：a new model of ureteropelvic junction obstruction［J］.Kidney Int，2005，67（1）：42-52.

［5］Seseke F，Thelen P，Heuser M，et al.Impaired nephrogenesis in rats with congenital obstructive uropathy ［J］.JUrol，2001，165（6）：2289-2292.

（編輯 孫憲民，英文編輯 鄭華川）

Renal Pathological Appearance and Podocyte Phenotype after the Ureteral Obstruction

YUXue-xin1，WANGChang-lin2，SUNRong-guo2，YANGYi2
（Department of Pediatrics；2.Department of Pediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo find time point of the irreversible kidney injury by observing renal pathological appearance and podocytes phenotype after complete ureteral obstruction.MethodsThe animal model of complete unilateral ureteral obstruction was constructed in 2-weekold and 2-month-old rats respectively.HEstaining was employed to evaluate the degree of pathological changes，and immunofluorescence double staining to observe the transitional progression of podocyte.ResultsGrossly，there appeared pyelectasis at 2h after obstruction and thinner renal cortex after 3days of obstruction.Histologically，proximal tube display dilated and hydropic degeneration of tubular epithelial cells was observed after 12-day obstruction.The tubular epithelium showed distorted swelling after 3-day obstruction.Immunofluorescence double staining showed that podocytes decreased and the double-labeled macrophages was increased during 1d to 2d after unilateral ureteral obstruction operation.ConclusionCompared with control groups，the unilateral ureteral obstruction groups shows podocyte-to-macrophage transition at 1d after the operation，while the pelvis shows obviously dilated.From the 1st day to the 7th day after unilateral ureteral obstruction，it shows increasing tendency of the podocytes transition.

unilateral ureteral obstruction；podocyte cell transition；renal injury

R692.2

A

0258-4646（2010）01-0001-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（30672192）

于雪馨（1981-），女，助教，碩士.

楊屹，E-mail：yangy2@sj-hospital.org

2009-09-22