王新利，李卿，高婷，付立葉，王揚，蔣濤，姜又紅

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所第二研究室，沈陽 110001）

樹突狀細胞分泌的exosomes體外誘導(dǎo)特異性CTL抗腎癌的初步研究

王新利，李卿，高婷，付立葉，王揚，蔣濤，姜又紅

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所第二研究室，沈陽 110001）

目的 提取樹突狀細胞外來體（DC）分泌的外來體（exosomes），檢測其體外刺激同源T細胞活化和誘導(dǎo)特異性細胞毒性T細胞（CTL）抗腎癌769-P的免疫效應(yīng)。方法 從健康志愿者外周血單個核細胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，流式細胞術(shù)檢測DC的表型；通過超速離心法結(jié)合超濾法制備DC分泌的exosomes，透射電鏡觀察exosomes的形態(tài)，MTT法檢測DC分泌的exosomes誘導(dǎo)T細胞的增殖和特異性CTL對769-P的體外殺傷活性。結(jié)果 超速離心法結(jié)合超濾法能從DC上清中分離exosomes，并且腫瘤抗原致敏DC分泌的exosomes能有效促進T細胞的增殖及特異性CTL抗769-P效應(yīng)，T細胞增殖倍數(shù)達（1.68±0.22）%，CTL殺瘤活性為（38.23±2.16）%。結(jié)論 抗原致敏DC分泌的exosomes能有效誘導(dǎo)激活具有較強殺瘤活性的腫瘤特異性CTL。

樹突狀細胞；外來體；細胞毒性T細胞；腎癌

腎細胞癌簡稱腎癌，是最常見的腎臟惡性腫瘤，對放化療均不敏感。研究發(fā)現(xiàn)，腎癌有很強的免疫原性，因此免疫治療成為腎癌的重要輔助治療手段［1］。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，用于腫瘤免疫治療已經(jīng)取得了一定成果［2］。

外來體（exosomes）是DC分泌的一種直徑約30～100nm膜性微囊小體，富含DC的MHC-Ⅰ/Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子等多種生物活性分子，亦在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Zitvogel發(fā)現(xiàn)，抗原致敏DC來源的exosomes可以在小鼠體內(nèi)引起抗腫瘤效應(yīng)［3］，exosomes作為新型亞細胞疫苗的應(yīng)用前景引起了關(guān)注。本研究通過用腎癌細胞凍融抗原致敏DC后，提取DC分泌的exosomes，探討其體外刺激T細胞活化和誘導(dǎo)細胞毒性T細胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）抗腎癌細胞769-P的免疫效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

淋巴細胞分離液（Ficoll-Hypaue）購自天津灝洋生物有限公司；基因重組人GM-CSF購自廈門特寶生物工程有限公司；基因重組人IL-4購自美國PeproTech公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MTT購自美國Biosharp公司；CD80-FITC，CD86-PE，CD83-APC，HLA-DR-Percp 鼠抗人單克隆抗體購自美國BD公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；100kDa MWCOCentri plus超濾管及1000kDa MWCOCentri plus超濾管購自德國Sartorius公司。腎細胞癌細胞系769-P購自武漢典藏細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 769 -P腫瘤抗原制備及定量：反復(fù)凍融法制備769-P腫瘤抗原，BCA法測定蛋白濃度，0.22μm濾膜過濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)及表型測定：取10名健康志愿者外周抗凝血20ml，經(jīng)ficoll密度梯度離心獲得外周血單個核細胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC），PBS洗滌2次，用RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，收集懸浮細胞，-80℃凍存?zhèn)溆?；貼壁細胞加入終濃度為800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換液并補加細胞因子，于7d加入凍融抗原100μl誘導(dǎo)DC成熟（記為lyDC），同時設(shè)對照組為不加入凍融抗原（記為coDC），繼續(xù)培養(yǎng)2d。分別收集培養(yǎng)至9d的DC，用流式細胞儀測定表型。

1.2.3 exosomes的提取：采用超速離心法結(jié)合膜超濾法提取exosomes，收集培養(yǎng)至9d的DC上清，經(jīng)0.45μm濾器過濾，將濾過液800g離心30min，收集上清；將其移入1000kDa MWCO50ml超濾離心管中，4℃7500g離心30min，將濾過液移入100kDa MWCO50ml超濾離心管中，4℃7500g離心30min，收集上清液，用PBS在100kDa超濾離心管中4℃7500g離心30min，洗滌2次。得到的濃縮液即為exosomes，0.22μm濾膜過濾除菌，BCA法檢測蛋白濃度，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 透射電鏡觀察下exosomes的形態(tài)鑒定：取20μlexosome原液滴于載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1min；用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20g/L磷鎢酸（pH6.8）約30μl于銅網(wǎng)上，室溫負染 1min；用濾紙吸干負染液，在白熾燈下烤干后，于透射電鏡下觀察并照相。

1.2.5 exosomes對T細胞增殖的影響：將凍存的T細胞于7d復(fù)蘇培養(yǎng)，9d用于實驗。調(diào)整T細胞濃度為1×106/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，分別加入 lyDC（DC∶T＝1∶10）、lyDC-exo（10μg/ml）coDC、coDC-exo，對照孔加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于 37℃，5%CO2培養(yǎng) 5d。每孔加入 20μl MTT（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄上清，每孔加入 200μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩5min，用酶標儀檢測490nm波長OD值，計算刺激指數(shù)（SI）。SI=實驗組OD值/對照組OD值。

1.2.6 exosomes對T細胞殺瘤活性的影響：調(diào)整T細胞濃度為 1×106/ml，將 lyDC（DC∶T＝1∶10）、ly－DC-exo（10μg/ml）、coDC、coDC-exo，與 T細胞混合培養(yǎng)3d，不同刺激組T細胞為效應(yīng)細胞，對數(shù)生長期的769-P為靶細胞，按效靶比為20∶1，接種于96孔板，共孵育24h后，計算殺瘤活性。殺瘤活性＝［殺傷率（%）=［1-﹙實驗組OD值-單獨效應(yīng)細胞OD值）/單獨靶細胞OD值］×100。1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 DC表型分析

腫瘤細胞凍融抗原致敏DC后，DC表面成熟標志CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表達明顯增加，與未負載組相比有顯著性差異（P＜0.01）。（見表1）。提示凍融抗原致敏DC可以誘導(dǎo)DC的成熟。

表1DC表面免疫分子的表達情況（±s，%）Ta b.1Fl o wc y t o me t r y a n a l y s i s o f d e n d r i t i c c e l l s（±s，%）Item CD80 CD83 CD86 HLA-DRlyDC 42.37±2.05 26.05±1.27 39.56±2.14 45.89±1.85coDC 10.26±2.541） 6.69±2.471） 7.56±1.651） 13.27±1.761）1）P ＜ 0.01vs LyDCgroup.

2.2 exosomes的電鏡觀察

經(jīng)BCA檢測，每107DC產(chǎn)生的exosomes蛋白濃度為1872μg/ml。透射電鏡下，exosomes為直徑為30～100nm的膜性微囊，圓形或橢圓形，有完整包膜（圖 1）。

2.3 exosomes對T細胞的促增殖作用和CTL殺瘤活性的檢測

抗原致敏DC及其分泌的exosomes均能刺激T細胞增殖和誘導(dǎo)CTL殺瘤活性，兩者相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），與無抗原致敏組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；無抗原致敏的DC及其分泌的exosomes不能刺激明顯的T細胞增殖和誘導(dǎo)CTL殺瘤活性，兩者相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2e x o s o me s對T細胞的促增殖作用和誘導(dǎo)CTL殺瘤活性（±s）Ta b.2Pr o l i f e r a t i o no f Tc e l l s a n dc y t o t o x i c i t y o f CTLs i n d u c e db y e x o s o me s（±s）Item Tcell proliferation Cytotoxicity of CTL（%）LyDC 1.95±0.19 53.55±1.10lyDC-Exo 1.68±0.221） 38.23±2.161）coDC 1.12±0.301），2） 10.33±2.081），2）coDC-Exo 1.07±0.271），2），3） 9.49±1.931），2），3）1）P ＜ 0.05vs LyDCgroup；2）P ＜ 0.05vs LyDC-Exo；3）P ＞ 0.05vs CoDC.

3 討論

DC作為抗原提呈功能最強的一類抗原提呈細胞，是機體免疫應(yīng)答的始動者，能夠顯著活化初始T細胞進行增殖［4］。利用DC免疫特性進行腫瘤的生物治療已成為研究的熱點，DC抗腫瘤疫苗在乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌等方面已經(jīng)取得了初步的進展［5］。然而，在臨床應(yīng)用中仍存在一定的問題［6］，包括體外培養(yǎng)繁瑣、長期保存比較困難等問題。

exosomes可由多種細胞分泌［7］，是細胞內(nèi)多泡體（multivesicular bodies，MVB）與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的一種膜性囊泡［8］。DC來源的exosomes攜帶DC的功能蛋白并且理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存，在抗腫瘤免疫中具有重要的潛能［9］。本實驗通過超速離心結(jié)合膜超濾法提取exosomes，直徑為30～100nm的膜性微囊結(jié)構(gòu)，與文獻報道相符［3］。

本實驗顯示，無抗原致敏的DC及其分泌的exosomes均不能有效誘導(dǎo)T細胞增殖和CTL殺瘤活性，提示未經(jīng)活化的DC及其分泌的exosomes性質(zhì)相同，不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)；而抗原致敏DC分泌的exosomes能有誘導(dǎo)T細胞增殖和CTL殺瘤活性，比抗原致敏DC誘導(dǎo)作用弱。這可能與exosomes的免疫原性低于DC有關(guān)［10］，可以采用一些策略提高exosomes的抗腫瘤效應(yīng)［11］。雖然目前對于exosomes生物學功能的研究尚處于早期摸索階段，但不管怎樣，DC分泌的exosomes作為一種新型亞細胞結(jié)構(gòu)，因其可有效的誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤活性，隨著臨床標準的制定，相信在腫瘤免疫治療中可能具有廣泛的應(yīng)用前景。

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（編輯 孫憲民，英文編輯 鄭華川）

APreliminary Study on Antitumor Effect of Specific Cytotoxic TLymphocytes Activated by Exosomes Secreted from Dendritic Cell Against Renal Carcinoma

WANGXin-li，LIQing，GAOTing，F(xiàn)ULi-ye，WANGYang，JIANGTao，JIANGYou-hong
（The Second Laboratory，Cancer Research Institute，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo extract exosomes from dendritic cell（DC）and investigate antitumor effect of the special cytotoxic Tlymphocytes activated by exosomes against 769-P.MethodsMonocytes from peripheral blood of healthy donors were cultured to induce DCin intro and their phenotypes were analyzed by FACS.The exosomes were extracted from DCby ultrafiltration and ultracentrifugation and observed under electric microscope.Proliferation of Tcells and the cytotoxicities of CTLagainst 769-Pinduced by exosome were measured by MTT.ResultsThe exosomes could be separated from culture supernatant of DCby ultrafiltration and ultracentrifugation.The combination of the exosomes from DCand the 769-Pantigen could effectively stimulate Tcell proliferation and enhance their cytotoxicity，the absorption value of Tcell proliferation（1.68±0.22），the cytotoxicity of CTL（38.23±2.16）%.ConclusionThe exosomes extracted by ultrafiltration and ultracentrifugation can present tumor antigen to Tcells and induce the cytotoxicity of CTL.

dendritic cell；exosome；cytotoxic Tlymphocyte；renal carcinoma

R730.51

A

0258-4646（2010）01-0004-03

遼寧省自然科學基金資助項目（20042093）

王新利（1984-），女，碩士研究生.

姜又紅，E-mail：jiangyouhong2000@yahoo.com.cn

2009-09-20