刁延娜，馬蘭蘭，2，孟凡彪，李宏圖，龐希寧

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.發(fā)育生物學(xué)教研室；2.生理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)大鼠損傷脊髓的功能恢復(fù)

刁延娜1，馬蘭蘭1，2，孟凡彪1，李宏圖1，龐希寧1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.發(fā)育生物學(xué)教研室；2.生理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

目的 研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植對(duì)大鼠脊髓損傷的作用。方法 將大鼠MSCs移植到大鼠脊髓損傷處，移植后評(píng)估大鼠行為學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色法觀察BrdU標(biāo)記的MSCs在脊髓損傷處存活情況，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）逆行示蹤，觀察脊髓損傷處神經(jīng)通路的重構(gòu)建，皮層體感誘發(fā)電位（CSEP）測(cè)定脊髓損傷處神經(jīng)通路傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。結(jié)果 術(shù)后移植組評(píng)分均高于損傷組，移植組大鼠脊髓損傷區(qū)遠(yuǎn)端檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，脊髓損傷近側(cè)端檢測(cè)到HRP陽(yáng)性細(xì)胞，CSEP波形恢復(fù)但波幅減低，潛伏時(shí)延長(zhǎng)。結(jié)論 MSCs可在損傷區(qū)存活并分化為神經(jīng)元，在損傷局部形成神經(jīng)元通路，使損傷脊髓的遠(yuǎn)端和近端建立聯(lián)系，神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能部分恢復(fù)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脊髓損傷；移植

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）能導(dǎo)致截癱、四肢癱，甚至更嚴(yán)重的后果，傳統(tǒng)治療效果不甚理想［1］。上世紀(jì)80年代始，有研究表明移植外周神經(jīng)和胎髓能促進(jìn)脊髓損傷軸突的再生［2，3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在特定條件下能分化為成骨、軟骨、肌肉，神經(jīng)元樣細(xì)胞［4］。目前尚無(wú)充分證據(jù)證明MSCs能夠恢復(fù)損傷脊髓的傳導(dǎo)功能。為此，我們首先建立了大鼠脊髓半橫斷損傷模型，通過(guò)將MSCs移植到受損區(qū)，采用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）逆行示蹤、皮層體感誘發(fā)電位（cortex somatosensory evoked potential，CSEP）測(cè)定等技術(shù)來(lái)探討MSCs在脊髓傳導(dǎo)功能損傷修復(fù)中的作用。取2～4月齡雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下取股骨和脛骨，暴露骨髓腔，用培養(yǎng)液沖洗，收集骨髓細(xì)胞，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。無(wú)菌條件下取大鼠股骨和脛骨培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

1 材料與方法

1.1 材料

2～4 個(gè)月齡Wistar大鼠，CD45、CD90兔抗鼠多克隆抗體（Santa Cruz），HRP（上海生工），BrdU、BrdU小鼠抗大鼠單克隆抗體（Sigma），SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色系統(tǒng)（武漢博士德）、FITC耦聯(lián)的山羊抗兔抗體（中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的分離培養(yǎng)與鑒定：無(wú)菌條件下取大鼠股骨和脛骨，培養(yǎng)液沖洗髓腔收集骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，取3～4代MSCs，消化后接種于蓋玻片上行免疫熒光染色，一抗分別為兔抗鼠CD45和兔抗鼠CD90多克隆抗體，二抗為山羊抗兔FITC標(biāo)記的抗體，DAPI復(fù)染核。

1.2.2 BrdU標(biāo)記 取3～4代MSCs，移植前48h更換新鮮培養(yǎng)液，加入BrdU終濃度為20μmol/L，移植時(shí) PBS懸浮，調(diào)整密度為 5×104/μl。

1.2.3 脊髓損傷模型制備與分組：麻醉大鼠后，在T12與L1椎骨平面打開(kāi)椎管，暴露L3節(jié)段脊髓，尖刀沿背側(cè)正中溝插入，刀刃向左側(cè)至前正中裂切開(kāi)，明膠海綿壓迫止血并縫合。模型動(dòng)物隨機(jī)分成3組，每組6只。正常組：動(dòng)物只實(shí)施切皮、打開(kāi)椎管，不施行脊髓損傷；損傷組：L3節(jié)段半橫斷損傷；移植組：在L3節(jié)段半橫斷損傷后立即用10μl微量注射器向損傷區(qū)的遠(yuǎn)端注射10μl細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為5×104/μl），損傷組注射等量的PBS。注射后留針2～3min，傷口局部滴加慶大霉素防止感染。術(shù)后7d內(nèi)每日給動(dòng)物腹腔注射慶大霉素，擠壓膀胱排尿至自身排尿反射恢復(fù)。

1.2.4 行為學(xué)評(píng)估：所有模型大鼠在術(shù)前和術(shù)后1d、1W、2W、3W、4W和 8W進(jìn)行 BBB評(píng)分［5］，完全癱瘓為0，正常為21，所有觀察均在下午進(jìn)行。

1.2.5 HRP逆行示蹤：取材前48h，麻醉大鼠后于股骨后做一橫行切口，暴露坐骨神經(jīng)，用5μl微量注射器將20%HRP2μl緩慢注入坐骨神經(jīng)束內(nèi)，留針2min，縫合肌肉、皮膚，傷口及皮下局部滴加慶大霉素防止感染。

1.2.6 CSEP測(cè)定：術(shù)后2個(gè)月行CSEP檢查。麻醉動(dòng)物，暴露其左側(cè)坐骨神經(jīng)，用保護(hù)電極輕輕挑起，周圍以神經(jīng)蠟封敷防止神經(jīng)干干燥及刺激電流擴(kuò)散。經(jīng)Nihon Kohden電刺激儀給與直流方波電脈沖刺激，電壓為25mV，頻率為1/300Hz。信號(hào)經(jīng)放大器放大，收集，描記儀記錄。

1.2.7 取材及切片：術(shù)后1周和2個(gè)月，大鼠麻醉后取出L1～L4節(jié)段脊髓，固定脫水后常規(guī)冷凍切片機(jī)切片，片厚 30μm。

1.2.8 HRP的呈色反應(yīng)

1.2.9 BrdU呈色反應(yīng)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的大鼠MSCs CD45陰性（圖1－1），CD90陽(yáng)性（圖 1－2）。術(shù)后 2個(gè)月，HRP逆行示蹤顯示損傷組未見(jiàn)HRP陽(yáng)性細(xì)胞，移植組在損傷近端脊髓腹側(cè)角檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞，但數(shù)量少（圖1－3、1－4），術(shù)后7d實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷區(qū)檢測(cè)到BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，棕色背景上有淺藍(lán)色遮蓋，提示移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓內(nèi)存活（圖1－5、1－6）。

2.2 后肢功能評(píng)價(jià)

所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的評(píng)分均為21，損傷組和移植組動(dòng)物在脊髓半橫斷后，左側(cè)后肢完全癱瘓，術(shù)后1d評(píng)分為0，術(shù)后1W損傷組和移植組評(píng)分分別為 2.3±0.58，0；4W為 12.7±0.578，5.3±0.57；8W18.7±1.15，8.7±0.57。損傷組與移植組在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，BBB評(píng)分有差異（圖2）。

2.3 CSEP測(cè)定

脊髓損傷術(shù)后2個(gè)月，損傷組大鼠未見(jiàn)誘發(fā)電位產(chǎn)生（圖 3－2），與正常組（圖 3-1）相比較，移植組大鼠的CSEP波形恢復(fù)但潛伏期延長(zhǎng)，波幅減低（圖3－3）。

3 討論

MSCs易于獲得、分離，擴(kuò)增，在用于自體移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面有巨大的潛能。

術(shù)后1W、2W、3W、4W，8W每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分移植組均高于對(duì)照組。Mahmood等［4］曾將BrdU標(biāo)記的MSCs移植進(jìn)腦損傷模型鼠體內(nèi)，檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性的MSCs。因此，我們?cè)谘芯恐型ㄟ^(guò)BrdU體外標(biāo)記MSCs以追蹤其移植進(jìn)脊髓損傷區(qū)后的命運(yùn)。移植1W后免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果表明在脊髓損傷區(qū)遠(yuǎn)端均有BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存在，推測(cè)移植的MSCs可在損傷區(qū)域存活。HRP技術(shù)將HRP注入到損傷脊髓部位遠(yuǎn)側(cè)的周圍神經(jīng)或組織中，軸漿的逆行運(yùn)輸可將標(biāo)記物帶到損傷處，如軸突完整，標(biāo)記物將通過(guò)損傷處繼續(xù)向近側(cè)移動(dòng)［6］。我們移植組術(shù)后2個(gè)月在脊髓損傷近側(cè)端的腹側(cè)角檢測(cè)到HRP陽(yáng)性細(xì)胞，表明移植的MSCs可能在損傷區(qū)分化為神經(jīng)元，在損傷局部形成神經(jīng)通路，從而使損傷區(qū)遠(yuǎn)端和近端神經(jīng)建立聯(lián)系，促進(jìn)神經(jīng)通路重新構(gòu)建，也可能因移植的MSCs促進(jìn)了損傷神經(jīng)細(xì)胞軸突的再生。一般認(rèn)為CSEP的出現(xiàn)反映脊髓感覺(jué)通道的功能［6］。有研究顯示，大鼠神經(jīng)干細(xì)胞脊髓內(nèi)移植后通過(guò)皮層體感誘發(fā)電位測(cè)定，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的波形有部分恢復(fù)，對(duì)照組無(wú)波形的恢復(fù)，神經(jīng)干細(xì)胞移植能促進(jìn)損傷脊髓傳導(dǎo)功能的部分恢復(fù)［7］。本研究中正常大鼠CSEP波形圖似“W”，術(shù)后2月移植組的波形有恢復(fù)，但潛伏期延長(zhǎng)，波幅下降，而在損傷組大鼠無(wú)CSEP產(chǎn)生，說(shuō)明在移植了MSCs的大鼠脊髓損傷區(qū)局部可能重新形成部分神經(jīng)通路，而在移植了PBS的大鼠脊髓損傷區(qū)局部無(wú)神經(jīng)通路的重新形成，MSCs可能促進(jìn)脊髓損傷后傳導(dǎo)功能的部分恢復(fù)。在我們的研究中，MSCs在移植前未施加某種處理因素，通過(guò)HRP逆行示蹤，CSEP測(cè)定觀察到MSCs移植促進(jìn)了損傷脊髓神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。如果給予MSCs某種處理因素后再移植，也許能更好地促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

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（編輯 孫憲民，英文編輯 鄭華川）

Transplantation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Functional Recovery of the Injured Rats Spinal Cord

DIAOYan-na1，MALan-lan1，2，MENGFan-biao1，LIHong-tu1，PANGXi-ning1
（1.Department of Developmental Biology，2.Department of Physiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on functional recovery of the injured rats spinal cord.MethodsMSCs labeled with Brdu were transplanted into rats model of spinal cord half-transection injury.The open-field BBBscoring system was employed to evaluate behavioral changes.MSCs’survival after transplantation was identified by BrdUimmunohistochemistry.We observed the reconstruction of neuronal circuits by HRPcoloration.The recovery of transduction function after spinal injury was examined by cortex somatosensory evoked potential（CSEP）.ResultsTreated rats generally showed better functional recovery than control rats after operation.BrdU-positive cells could be found in the spinal cord injury site one week after transplantation.At two months after transplantation，HRP-positive cells could be found at rostral of the spinal cord injury site of treated rats，but not be found in control.CSEPcould be evoked at treated rats from two months after transplantation，but not in controls.ConclusionMSCs may survive in the spinal cord injury site via local injection immediately after spinal cord injury，and may promote regeneration of the injured axons.

mesenchymal stem cells；spinal cord injury；transplantation

R681.5

A

0258-4646（2010）01-0007-03

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20062090）；遼寧省教育廳高?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目（2004D227）

刁延娜（1975-），女，碩士研究生.

龐希寧，E-mail：pxining@yahoo.com

2009-09-10