梁朝寧，薛燕芬，馬延和

1 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

1 概述

生物質(zhì) (Biomass) 主要由一系列作為結(jié)構(gòu)支撐、儲能組分的多糖構(gòu)成。而它的重要組成之一——木質(zhì)纖維素分布廣泛、成本低廉并且在利用過程中對環(huán)境的副作用小，因而是生物能源研究領(lǐng)域中頗具潛力的原料。木質(zhì)纖維素的重要來源是可再生的農(nóng)業(yè)殘料 (如秸稈) 和工業(yè)廢料 (如紙漿廢料等)。它的主要組成是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[1]。纖維素是由葡萄糖單元經(jīng) β-1,4-糖苷鍵連接起來的同源多糖長鏈。最小的重復(fù)單位是纖維二糖。纖維素高級結(jié)構(gòu)中，規(guī)則排列的糖鏈間易形成氫鍵，從而形成結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)、致密的微晶結(jié)構(gòu)。在對里氏木霉Trichoderma reesei纖維素降解酶系研究后，發(fā)現(xiàn)天然纖維素降解是由多種酶協(xié)同作用完成的。首先，內(nèi)切葡聚糖酶 (EC 3.2.1.4) 從內(nèi)部隨機(jī)切割多糖糖鏈，從而生成長短不一的短鏈。隨后，外切纖維素酶 (EC 3.2.1.74) 從糖鏈末端進(jìn)行水解，生成 D-葡萄糖；或者外切葡聚糖纖維二糖水解酶 (EC 3.2.1.91) 水解葡聚糖生成D-纖維二糖。最后，β-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21) 將這些短鏈纖維素 (尤其是纖維二糖) 水解生成葡萄糖[2]。半纖維素是由幾種不同類型的單糖 (包括五碳糖和六碳糖) 構(gòu)成的異質(zhì)多聚體。它的含量和組成因來源于不同植物或同一植物的不同部位而有所差別。由于復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，水解利用半纖維素往往需要多種酶共同作用，如木聚糖酶、甘露聚糖酶等。木質(zhì)素是由聚合的芳香醇構(gòu)成的一類物質(zhì)，主要存在于植物的次生壁中，通過與多糖組分 (尤其是半纖維素) 共價結(jié)合形成交織網(wǎng)來硬化細(xì)胞壁，起抗壓作用。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)組成的復(fù)雜性，是植物界對抗微生物侵?jǐn)_的天然屏障，同時也制約了降解、利用這一生物資源的相關(guān)技術(shù)的開發(fā)[3-4]。

為了提高木質(zhì)纖維素的水解利用、降低生產(chǎn)成本，一種策略是發(fā)掘新酶資源或者提高天然酶的性能；但單一酶往往難以實(shí)現(xiàn)這一復(fù)雜混合物的有效水解，于是另一研究策略是開發(fā)利用能通過協(xié)同作用、高效降解木質(zhì)纖維素的體系，包括多酶體系和菌群[4]。這就好比構(gòu)建一個降解木質(zhì)纖維素的工作車間，而每一種酶 (菌) 都是車間內(nèi)的機(jī)器。本文概述了現(xiàn)有微生物降解利用木質(zhì)纖維素體系的研究進(jìn)展，如纖維小體和在此基礎(chǔ)上理性設(shè)計(jì)的人工纖維小體、菌群共培養(yǎng)、工程菌改造等，展望了這些技術(shù)的應(yīng)用前景，以期實(shí)現(xiàn)天然生物質(zhì)木質(zhì)纖維素到目的產(chǎn)品乙醇的高效轉(zhuǎn)化。

2 游離酶降解木質(zhì)纖維素

可降解纖維素的好氧微生物，如好氧真菌 (如里氏木霉) 或絕大多數(shù)的好氧細(xì)菌 (如 Thermobifida fusca)，它們能合成多種纖維素水解酶。在降解木質(zhì)纖維素底物時，這些酶蛋白在表達(dá)順序、組成比例、水解方式上相互協(xié)調(diào)，可逐步實(shí)現(xiàn)底物的有效降解[5-6]。酶系之間的協(xié)同作用包括：內(nèi)切酶與外切酶的協(xié)同作用，外切酶之間的協(xié)同作用，以及外切酶與 β-葡糖苷酶的協(xié)同作用等。此外，酶系中還存在多功能酶，有些酶由多個不同家族的催化區(qū)域構(gòu)成，如Anaerocellum thermophilum、Caldicellulosiruptor sp.或Paenibacillus polymyxa GS01產(chǎn)生的多功能纖維素酶，同時具備纖維素酶、半纖維素酶活性[2-3]；有些酶則具有多個底物結(jié)合區(qū) CBM[7]，可以與多種底物相結(jié)合。多功能酶蛋白分子內(nèi)的催化單元促進(jìn)了協(xié)同作用，使得水解過程能有序高效進(jìn)行。關(guān)于這一部分內(nèi)容可參考Lynd等的綜述[8]，本文不作詳述。

3 纖維小體降解木質(zhì)纖維素

發(fā)現(xiàn)于厭氧微生物中的多酶催化體系——纖維小體 (Cellulosome) 具有完備的協(xié)同方式。纖維小體是多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定-粘附機(jī)制形成的、能通過細(xì)胞粘附蛋白附著在細(xì)菌細(xì)胞壁上，高效徹底地降解天然纖維素材料的多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)。它是由 Bayer等從纖維素降解細(xì)菌 Clostridium thermocellum中首次分離得到的[9]。通常，纖維小體由兩部分組成：其一是各種具有催化能力且能協(xié)同作用的酶類；其二是非催化功能的支架 (Scaffoldin)，由于它由多種黏連蛋白 (Cohesin) 模塊組成，因此是多種水解酶組合形成復(fù)合體的支撐結(jié)構(gòu)[10]?，F(xiàn)已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)纖維小體，它們主要分布于厭氧細(xì)菌Clostridium屬Cluster Ⅲ中[2]，但有研究表明在好氧細(xì)菌 (如 Thermobifida fusca) 或一些厭氧真菌 (如 Neocallimastix、Piromyces和 Orpinomyces)中可能也存在類纖維小體結(jié)構(gòu)[11-12]。纖維小體高效降解天然纖維素的 2個關(guān)鍵因素是：第一，結(jié)構(gòu)中包含多個對不同底物具有結(jié)合功能的CBM；第二，多個不同家族的酶蛋白在空間位置上鄰近，在催化方式上具有協(xié)同作用。纖維小體對纖維素類生物質(zhì)的降解有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景，在此基礎(chǔ)上，模擬纖維小體的協(xié)同作用方式、人工設(shè)計(jì)構(gòu)建纖維小體也是世界范圍內(nèi)的研究課題。

3.1 纖維小體的結(jié)構(gòu)研究

為了合理設(shè)計(jì)人工纖維小體，有必要深入理解纖維小體的構(gòu)型和組成。Hammel等用X射線散射的方法深入研究了纖維小體的結(jié)構(gòu)。研究表明，纖維小體組裝過程與被稱為連接區(qū)的支架蛋白上的特定區(qū)域有關(guān)。這一區(qū)域的結(jié)構(gòu)柔性有效地克服了相鄰黏附蛋白之間的空間位阻效應(yīng)[13]。Madkour和Mayer用電子顯微鏡 (Electron microscopy，EM) 觀察了C. thermocellum的纖維小體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在球狀顆粒的孔洞中存在的可能是支架蛋白的微絲結(jié)構(gòu)，而催化蛋白則分布于外殼層上[14]。但是Mingardon指出，EM觀察中因?yàn)槭褂昧斯潭夹g(shù)，可能不能真實(shí)反映纖維小體的生理結(jié)構(gòu)；在結(jié)合并降解包含結(jié)晶纖維素和無定形纖維素的異質(zhì)底物時，纖維小體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能會發(fā)生變化[15]。

3.2 人工設(shè)計(jì)纖維小體

人工纖維小體的概念1994年由Bayer等提出。它的基本理念是設(shè)計(jì)構(gòu)建一個分泌型的纖維素酶類或半纖維素酶類的復(fù)合體，通過各酶之間的協(xié)同作用，高效降解木質(zhì)纖維素[16]。為了實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想，通過基因重組技術(shù)，不同來源的纖維素酶與來自于纖維小體的錨定蛋白 (Dockerin) 相融合，并組裝在能與錨定蛋白互補(bǔ)結(jié)合的黏連蛋白構(gòu)成的人工支架蛋白上形成有機(jī)復(fù)合體。Murashima等首次實(shí)現(xiàn)了體外重組人工纖維小體的合成與組裝。他們構(gòu)建的纖維小體結(jié)構(gòu)包括：催化區(qū)域、支架蛋白、CBM區(qū)、細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)和黏連蛋白[16]，見圖 1。這一基本結(jié)構(gòu)框架為日后人們設(shè)計(jì)人工纖維小體提供了依據(jù)。

3.2.1 人工纖維小體的設(shè)計(jì)實(shí)例

人工纖維小體技術(shù)的優(yōu)勢在于：首先，為了更好地發(fā)揮協(xié)同作用，來自不同天然纖維小體的酶蛋白可以重新組合；其次，將不同來源、可作用于不同底物的水解酶組合構(gòu)建的人工纖維小體，有助于擴(kuò)大底物作用范圍。比之天然游離酶，通過合理設(shè)計(jì)纖維小體、發(fā)揮各催化單元之間的協(xié)同作用，人工纖維小體在催化能力和底物作用范圍等方面都有所改進(jìn)。

圖1 纖維小體結(jié)構(gòu)框架示意圖[17]Fig. 1 A simplified schematic of general cellulosome composition[17].

Fierobe等設(shè)計(jì)合成了一種由 2種纖維素酶(Cel9G和Cel48F) 構(gòu)成雙功能的纖維小體[18]。在此基礎(chǔ)上，這一小組又將不同來源的黏連蛋白將 2種纖維素酶和 1種半纖維素酶組合起來。這一三功能人工纖維小體的催化能力較之游離酶提高了7倍[19]。Cha等設(shè)計(jì)構(gòu)建的微型人工支架用來自 Clostridium cellulovorans的黏連蛋白將內(nèi)切葡聚糖酶或木聚糖酶組合起來，使這一復(fù)合體對多種纖維素類底物的催化能力較游離酶都有顯著提高[20]。同樣，Mingardon等將一種真菌來源的纖維素酶插入細(xì)菌纖維小體，使得水解活力較之游離酶提高了26倍[11]。

雖然有很多成功的人工纖維小體報(bào)道，但并不能把纖維小體簡單地理解為纖維素酶類的聚合體。天然纖維小體微妙的結(jié)構(gòu)、組成說明它的催化能力和底物作用范圍的設(shè)計(jì)遵循著一定的內(nèi)在規(guī)律。如Thermobifida fusca的糖苷水解酶家族6的兩種纖維素酶的CBM區(qū)被替換成錨定蛋白，從而將在天然纖維小體中從未發(fā)現(xiàn)過的家族6纖維素酶引入纖維小體，但這一人工纖維小體盡管對不定型纖維素底物的催化能力是游離型酶的14倍，卻對可溶底物 (如羧甲基纖維素鈉) 的催化能力卻有所下降[21]。而用同樣方法將糖苷水解酶家族 48的外切纖維素酶插入纖維小體，與游離酶相比，纖維小體對可溶纖維素和結(jié)晶纖維素的催化能力都有所提高[22]。這說明，纖維小體各催化單元的選擇上具有一定的偏好性；比之糖苷水解酶家族6的纖維素酶，家族48的纖維素酶可能更適于纖維小體的構(gòu)建。

纖維小體的組成、各組成單元的空間位置等都對這一復(fù)合體的協(xié)同方式、催化能力有影響。Mingardon等試圖通過對纖維小體的兩種主要構(gòu)成酶 (Cel48和Cel9的纖維素酶) 融合CBM區(qū)或錨定蛋白來提高纖維小體的催化能力，但是結(jié)果表明，改造后的纖維小體雖然對結(jié)晶型纖維素的催化能力提高，但是對不定型纖維素的水解能力下降。同時，比之僅包含野生型蛋白的人工纖維小體，改造后、包含不同CBM區(qū)或者錨定蛋白的纖維素酶構(gòu)建的各種纖維小體對結(jié)晶纖維素的催化能力均有所下降[15]。對人工纖維小體來說，組成單元的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和各組成纖維素酶的可活動范圍都對纖維小體的催化能力有重要影響。在另一篇文章中，為了研究催化區(qū)域的柔性與催化能力的關(guān)系，纖維素酶 Cel5A的催化區(qū)域與錨定蛋白由不同長度的連接區(qū)相連接后插入纖維小體中后，測試各組合的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)：催化能力與連接蛋白的長度無關(guān)，而與錨定蛋白與催化中心結(jié)合的位置相關(guān)[23]。為了研究纖維小體各組成單元之間以及纖維小體酶蛋白與游離酶的相互作用關(guān)系，Bayer等在纖維小體組成酶 Cel48和 Cel9構(gòu)建了一系列包含不同 CBM或錨定蛋白組合的嵌合重組蛋白，但有趣的是，纖維小體構(gòu)成酶轉(zhuǎn)化為游離酶時仍具有一定協(xié)同能力，而反之，大多數(shù)游離酶只有在不作改造 (如不增加 CMB區(qū)或錨定蛋白)，以野生型的形態(tài)組裝成為纖維小體時才具有協(xié)同能力[23-24]。

這些實(shí)驗(yàn)說明為了開發(fā)高效降解人工纖維小體，研究者仍需要深入研究纖維小體的協(xié)同機(jī)制和各個組成部分在整個催化體系中發(fā)揮的功用。

3.2.2 人造纖維小體的異源合成和組裝

人工纖維小體可在多種原核表達(dá)系統(tǒng)中合成并組裝，生成有催化活性的復(fù)合體。

Murashima曾利用胞外蛋白酶缺陷型 Bacillus subtilis WB800合成來自于C. cellulovorans的微型纖維小體[25]。能夠產(chǎn)生不具有纖維素酶活性的纖維小體的C.acetobutylicum ATCC 824也被用于來自C. thermocellum和C. cellulolyticum的纖維小體的合成并分泌至胞外[26]。而C. thermocellum的一種甘露聚糖酶和部分支架蛋白也可以C. acetobutylicum作為宿主得到活性表達(dá)[27]。

4 纖維素降解細(xì)菌共培養(yǎng)

細(xì)菌共培養(yǎng)體系也是提高木質(zhì)纖維素水解、增加產(chǎn)物利用率，從而提高最終目的產(chǎn)物得率的技術(shù)。設(shè)計(jì)一個穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系，不僅要考慮各組成菌的代謝過程中的協(xié)同作用，而且需優(yōu)化培養(yǎng)條件 (如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度等) 以維持組成菌群的平衡。

現(xiàn)有的共培養(yǎng)體系多是以僅能發(fā)酵六碳糖的C. thermocellum為核心，組合其他嗜熱厭氧微生物 (如 Thermoanaerobactium saccharolyticum、Thermoanaerobacter ethanolicus、C. thermohydrosulfuricum、Thermoanaerobium brockii等) 構(gòu)建[28-30]，見圖2。菌群在代謝作用上具有協(xié)同作用，如纖維素可被C. thermocellum高效水解成纖維二糖，進(jìn)而發(fā)酵成乙醇等目的產(chǎn)物；而半纖維素被C. thermocellum水解生成木二糖等五碳糖產(chǎn)物，隨之可被其他組成菌發(fā)酵成乙醇等終產(chǎn)物。

共培養(yǎng)體系的優(yōu)勢在于有機(jī)結(jié)合了多種代謝途徑，降低了單一菌發(fā)酵產(chǎn)生的有害產(chǎn)物對整個發(fā)酵系統(tǒng)的負(fù)面影響，同時簡化了發(fā)酵工藝的操作流程。但是，在木質(zhì)纖維素的降解中，共培養(yǎng)體系技術(shù)仍處于研究初期，菌群之間的協(xié)同方式有待進(jìn)一步研究。

5 其他策略

以上分別介紹了利用酶系或菌系降解木質(zhì)纖維素的體系，而進(jìn)一步的研究目標(biāo)是將這兩者有機(jī)結(jié)合起來，將多酶體系協(xié)同作用的策略應(yīng)用于工業(yè)菌株的改造中。利用基因工程技術(shù)，將異源的纖維素水解酶類轉(zhuǎn)入工程菌中，一方面可提高天然纖維素降解菌株發(fā)酵生成產(chǎn)物的得率，降低產(chǎn)物抑制作用；另一方面，通過引入新酶、利用其在功能上與菌株原有代謝途徑的協(xié)調(diào)，可改造非纖維素水解類菌株，使其直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等目的產(chǎn)物。Kondo的研究小組將里氏木酶的內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖酶，以及Aspergillu aculeatus的β-葡萄糖苷酶用表面展示技術(shù)在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的細(xì)胞表面表達(dá)，改造后菌株可利用不定型纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[31]。同樣，將木聚糖酶[32]或淀粉酶[33]在釀酒酵母的細(xì)胞表面表達(dá)后，改造菌株可發(fā)酵利用木聚糖或淀粉類底物合成乙醇。這一技術(shù)將纖維素降解酶類生產(chǎn)與工程菌相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了一步轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素底物為目的產(chǎn)品乙醇，有利于提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，是頗具應(yīng)用潛力的新型技術(shù)。

圖2 以C. thermocellum為中心、降解木質(zhì)纖維素共培養(yǎng)體系示意圖[17]Fig. 2 Simplified process using C. thermocellum and other microorganisms in co-culture for degradation of lignocellulose[17].

6 小結(jié)

木質(zhì)纖維素作為植物界抵抗微生物侵?jǐn)_的天然屏障，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組成多樣。單一功能的酶往往無法勝任木質(zhì)纖維素的降解，難以實(shí)現(xiàn)對它的充分利用。為了實(shí)現(xiàn)這一天然生物資源的高效降解，研究者提出聯(lián)合生物加工技術(shù) (Consolidated bioprocessing，CBP) 的概念，將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵結(jié)合起來，旨在實(shí)現(xiàn)一步發(fā)酵完成木質(zhì)纖維素到生物乙醇的轉(zhuǎn)化[34]。而多酶 (菌) 體系可通過纖維素降解酶或代謝途徑之間的協(xié)同作用，能以“加工工廠”的形式、以群體協(xié)同作用的方式實(shí)現(xiàn)這一天然多聚物的有效降解。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，有必要對多酶體系各組成單元的協(xié)同作用機(jī)理進(jìn)行深入的研究，比如酶單元的催化中心與底物結(jié)合區(qū)之間的關(guān)系，酶與底物之間的關(guān)系，纖維小體中各成員的空間位置、結(jié)構(gòu)組成對有效降解底物 (尤其是結(jié)晶纖維素) 的影響，共培養(yǎng)體系中各菌群代謝之間的協(xié)同方式等?；谶@些研究，人工設(shè)計(jì)構(gòu)建的多酶體系 (如人工纖維小體)、多菌體系 (如共培養(yǎng))以及將酶和菌株有機(jī)結(jié)合的體系 (工程菌代謝網(wǎng)絡(luò)改造) 將有助于研究者認(rèn)識纖維素降解的有機(jī)體系，在生物煉制細(xì)胞工廠中發(fā)揮作用。

REFERENCES

[1] Himmel ME, Ding SY, Johnson DK, et al. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science, 2007, 315(5813): 804?807.

[2] Schwarz WH. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56(5): 634?649.

[3] Wingren A, Galbe M, Zacchi G. Techno-economic evaluation of producing ethanol from softwood: comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks. Biotechnol Prog, 2003, 19: 1109?1117.

[4] Ding SY, Xu Q, Crowley M, et al. A biophysical perspective on the cellulosome: new opportunities for biomass conversion. Curr Opin Biotechnol, 2008, 19(3): 218?227.

[5] József M, Johan K, Dora L, et al. Hydrolysis of microcrystalline cellulose by cellobiohydrolase I and endoglucanase II from Trichoderma reesei: adsorption, sugar production pattern, and synergism of the enzymes. Biotechnol Bioeng, 1998, 59(5): 621?634.

[6] Watson D, Wilson D, Walker L. Synergism in binary mixtures of Thermobifida fusca cellulases Cel6B, Cel9A, and Cel5A on BMCC and Avicel. Appl Biochem Biotechnol, 2002, 101(2): 97?111.

[7] Cai S, Li J, Hu FZ, et al. Cellulosilyticum ruminicola, a newly described rumen bacterium that possesses redundant fibrolytic genes in the genome and degrades lignocellulose by multiple CBM-borne fibrolytic enzymes. Appl Environ Microbiol, 2010: 3124?3109.

[8] Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, et al. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev, 2002, 66(3): 506?577.

[9] Bayer EA, Kenig R, Lamed R. Adherence of Clostridium thermocellum to cellulose. J Bacteriol, 1983, 156(2): 818?827.

[10] Bayer EA, Shimon LJW, Shoham Y, et al. Cellulosomesstructure and ultrastructure. J Struct Biol, 1998, 124(2/3): 221?234.

[11] Mingardon F, Chanal A, Lopez-Contreras AM, et al. Incorporation of fungal cellulases in bacterial minicellulosomes yields viable, synergistically acting cellulolytic complexes. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(12): 3822?3832.

[12] Li XL, Chen H, Ljungdahl LG. Two cellulases, CelA and CelC, from the polycentric anaerobic fungus Orpinomyces strain PC-2 contain N-terminal docking domains for a cellulase-hemicellulase complex. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(12): 4721?4728.

[13] Hammel M, Fierobe H-P, Czjzek M, et al. Structural basis of cellulosome efficiency explored by small angle X-ray scattering. J Biol Chem, 2005, 280(46): 38562?38568.

[14] Madkour M, Mayer F. Structural organization of the intact bacterial cellulosome as revealed by electron microscopy. Cell Biol Int, 2003, 27(10): 831?836.

[15] Mingardon F, Chanal A, Tardif C, et al. Exploration of new geometries in cellulosome-like chimeras. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(22): 7138?7149.

[16] Bayer EA, Morag E, Lamed R. The cellulosome-a treasure-trove for biotechnology. Trends Biotechnol, 1994, 12(9): 379?386.

[17] Maki M, Leung KT, Qin W. The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int J Biol Sci, 2009, 5: 500?516.

[18] Fierobe HP, Bayer EA, Tardif C, et al. Degradation of cellulose substrates by cellulosome chimeras. J Biol Chem, 2002, 277(51): 49621?49630.

[19] Fierobe HP, Mingardon F, Mechaly A, et al. Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complex substrates. J Biol Chem, 2005, 280(16): 16325?16334.

[20] Cha J, Matsuoka S, Chan H, et al. Effect of multiple copies of cohesins on cellulase and hemicellulase activities of Clostridium cellulovorans mini-cellulosomes. J Microbiol Biotechnol, 2007, 17(11): 1782?1788.

[21] Caspi J, Irwin D, Lamed R, et al. Thermobifida fusca family-6 cellulases as potential designer cellulosome components. Biocatal Biotrans, 2006, 24(1): 3?12.

[22] Caspi J, Irwin D, Lamed R, et al. Conversion of Thermobifida fusca free exoglucanases into cellulosomal components: comparative impact on cellulose-degrading activity. J Biotechnol, 2008, 135(4): 351?357.

[23] Caspi J, Barak Y, Haimovitz R, et al. Effect of linker length and dockerin position on conversion of a Thermobifida fusca endoglucanase to the cellulosomal mode. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(23): 7335?7342.

[24] Vazana Y, Morais S, Barak Y, et al. Interplay between Clostridium thermocellum family-48 and family-9 cellulases in the cellulosomal versus non-cellulosomal states. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(10): 3236?3243.

[25] Murashima K, Chen CL, Kosugi A, et al. Heterologous production of Clostridium cellulovorans engB, using protease-deficient Bacillus subtilis, and preparation of active recombinant cellulosomes. J Bacteriol, 2002, 184(1): 76?81.

[26] Perret S, Casalot L, Fierobe HP, et al. Production of heterologous and chimeric scaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 824. J Bacteriol, 2004, 186(1): 253?257.

[27] Perret S, Belaich A, Fierobe HP, et al. Towards designer cellulosomes in Clostridia: mannanase enrichment of the cellulosomes produced by Clostridium cellulolyticum. J Bacteriol, 2004, 186(19): 6544?6552.

[28] Wiegel J. Formation of ethanol by bacteria. A pledge for the use of extreme thermophilic anaerobic bacteria in industrial ethanol fermentation processes. Cell Mol Life Sci, 1980, 36(12): 1434?1446.

[29] Lamed R, Zeikus JG. Ethanol production by thermophilic bacteria: relationship between fermentation product yields of and catabolic enzyme activities in Clostridium thermocellum and Thermoanaerobium brockii. J Bacteriol, 1980, 144(2): 569?578.

[30] Ng TK, Ben-Bassat A, Zeikus JG. Ethanol production by thermophilic bacteria: fermentation of cellulosic substrates by cocultures of Clostridium thermocellum and Clostridium thermohydrosulfuricum. Appl Environ Microbiol, 1981, 41(6): 1337?1343.

[31] Fujita Y, Ito J, Ueda M, et al. Synergistic saccharification, and direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(2): 1207?1212.

[32] Katahira S, Fujita Y, Mizuike A, et al. Construction of a xylan-fermenting yeast strain through codisplay of xylanolytic enzymes on the surface of xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae cells. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(9): 5407?5414.

[33] Shigechi H, Koh J, Fujita Y, et al. Direct production of ethanol from raw corn starch via fermentation by use of a novel surface-engineered yeast strain codisplaying glucoamylase and α-amylase. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(8): 5037?5040.

[34] Lynd LR, Zyl WHv, McBride JE, et al. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update. Curr Opin Biotechnol, 2005, 16(5): 577?583.