李正軍，魏曉星，陳國強(qiáng)

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的高分子生物聚酯，一般主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)[1-2]。儲(chǔ)存型的PHA以疏水性顆粒的形式存在，在一定條件下其含量可以超過細(xì)胞干重的 90%[3]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，PHA是羥基脂肪酸 (Hydroxyalkanoic acid，HA)的聚合物，結(jié)構(gòu)通式如圖 1所示，分子量一般為幾萬至幾百萬，不同的PHA及其單體具有不同的側(cè)鏈R基團(tuán)。根據(jù)單體組成的不同，PHA具有從堅(jiān)硬質(zhì)脆的硬塑料到柔軟的彈性體等一系列不同的材料學(xué)性質(zhì)。PHA可以由生物可再生資源為原料合成，進(jìn)入自然界后可以被細(xì)菌等生物完全降解，其替代傳統(tǒng)的不可降解的塑料可以緩解嚴(yán)重的“白色污染”問題，從而引起世界各國科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛重視[4-6]。

圖1 PHA的結(jié)構(gòu)通式Fig. 1 General structure of polyhydroxyalkanoates. m=1?4, n=100?30 000, R=alkyl groups C1～C15.

1 野生菌中的PHA生產(chǎn)

1.1 PHA的生物合成途徑

很多細(xì)菌能夠在自然條件下積累PHA，其生物合成途徑主要有3條 (圖2)，所需的酶及其底物特異性各有不同[3]。根據(jù)合成途徑的不同和相關(guān)酶的底物特異性，PHA的單體結(jié)構(gòu)也多種多樣，其中3-羥基脂肪酸單體包括了3-羥基丙酸到3-羥基十六酸的所有成員，此外還有 4-、5-、6-羥基脂肪酸以及含有不飽和鍵、帶有甲基側(cè)鏈或者其他功能基團(tuán)的3-羥基脂肪酸作為PHA單體的情況[7]。

1.1.1 由乙酰輔酶A合成PHB途徑

聚 3-羥基丁酸酯 (Polyhydroxybutyrate，PHB)是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、最早被發(fā)現(xiàn)的PHA成員，其生物合成途徑以羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha為代表 (圖2)。糖類碳源經(jīng)過糖酵解途徑生成乙酰輔酶 A，β-酮基硫解酶PhaA催化2個(gè)乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A，然后在NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶PhaB的作用下還原為(R)-3-羥基丁酰輔酶A，最后由PHA合酶PhaC聚合成PHB[8-9]。

1.1.2 由脂肪酸β-氧化途徑合成PHA

以銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa和豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviae為代表的細(xì)菌能利用脂肪酸的β-氧化途徑合成PHA (圖2)。β-氧化途徑的中間產(chǎn)物烯脂酰輔酶A在水合酶PhaJ的催化下形成(R)-3-羥基脂酰輔酶 A，再由 PHA合酶聚合成PHA[3]。

圖2 PHA的生物合成途徑Fig. 2 Polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis pathway. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; PhaG: 3-hydroxyacyl- ACP:CoA transacylase; PhaJ: enoyl-CoA hydratase; FadD: acyl-CoA synthase; YafH: fatty acyl-CoA dehydrogenase.

1.1.3 由脂肪酸從頭合成途徑合成PHA

以惡臭假單胞菌Pseudomonas putida為代表的細(xì)菌，能夠利用脂肪酸從頭合成途徑合成 PHA (圖2)。乙酰輔酶 A進(jìn)入脂肪酸的從頭合成途徑后，其中間產(chǎn)物(R)-3-羥基脂酰-ACP在酰基轉(zhuǎn)移酶 PhaG的催化下形成(R)-3-羥基脂酰輔酶 A，然后由 PHA合酶聚合成PHA[3]。

細(xì)菌合成PHA所利用的碳源中，結(jié)構(gòu)與PHA單體類似的被稱為相關(guān)碳源，如脂肪酸等；結(jié)構(gòu)與PHA單體不同的被稱為非相關(guān)碳源，如糖類碳源。很多細(xì)菌可以利用相關(guān)碳源合成包含有多種不同單體的PHA，如細(xì)菌可以利用3-羥基丙酸 (3HP)、4-羥基丁酸 (4HB) 和5-羥基戊酸 (5HV) 等相關(guān)碳源合成包含有3HP、4HB或5HV的PHA。

1.2 短鏈PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

短鏈PHA (Short-chain-length PHA，scl PHA) 的單體碳原子個(gè)數(shù)在3～5個(gè)之間，主要包括聚3-羥基丁酸酯、聚3-羥基丁酸3-羥基戊酸酯 (PHBV) 和聚3-羥基丁酸4-羥基丁酸酯 (P3HB4HB) 等。R. eutropha是最常見的scl PHA生產(chǎn)菌，它能利用糖類碳源積累超過細(xì)胞干重80%的PHB，細(xì)胞干重可達(dá)200 g/L以上；當(dāng)添加丙酸或4-羥基丁酸等作為3HV或4HB的前體時(shí)，R. eutropha能夠合成 PHBV 或者P3HB4HB。廣泛產(chǎn)堿菌Alcaligenes latus也可以用來生產(chǎn)PHB或PHBV，其優(yōu)點(diǎn)是生長(zhǎng)迅速，能利用蔗糖為碳源，但是PHB含量較低，一般只能達(dá)到細(xì)胞干重的50%左右。

1.3 中長(zhǎng)鏈PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

中長(zhǎng)鏈 PHA (Medium-chain-length PHA，mcl PHA) 的單體碳原子個(gè)數(shù)在6～14之間。嗜油假單胞菌Pseudomonas oleovorans能夠利用烷烴為碳源合成mcl PHA，采用兩步法連續(xù)發(fā)酵，前期積累生物量，后期限制氮源供給積累PHA，能夠獲得超過細(xì)胞干重60%的mcl PHA，產(chǎn)率為1.1 g/(L·h)[10]。P. putida可以利用脂肪酸作為碳源合成 mcl PHA，采用脈動(dòng)補(bǔ)料法，既可以防止碳源限制，又可以防止脂肪酸積累到可以產(chǎn)生抑制的濃度，36 h發(fā)酵可獲得生物量 131 g/L，PHA含量 59%，最大產(chǎn)率為2.3 g/(L·h)[11]。

1.4 短鏈中長(zhǎng)鏈共聚PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

短鏈中長(zhǎng)鏈共聚PHA (scl-mcl PHA) 是指3HB與長(zhǎng)鏈mcl 3HA單體 (C6～C14) 形成的共聚物，根據(jù)單體組成不同其性能可以從硬塑料到彈性體之間有很大調(diào)節(jié)空間。嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila可以利用超過12個(gè)碳原子的脂肪酸積累3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚酯 (PHBHHx)，Chen等[12]報(bào)道了在20 000 L的發(fā)酵罐中A. hydrophila兩步法培養(yǎng)生產(chǎn)PHBHHx的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞最初在50 g/L的葡萄糖中培養(yǎng)，之后在50 g/L的月桂酸中限磷培養(yǎng)，最終培養(yǎng)46 h后得到的細(xì)胞干重和PHA含量分別為50 g/L、50%，共聚物中3HHx的單體含量為11 mol%。

2 PHA生物合成的代謝工程改造

2.1 利用輔酶工程提高PHB的生物合成

NADPH在胞內(nèi)主要作為氫的傳遞體參與生物合成反應(yīng)，例如氨基酸和脂肪酸的合成等。PHB的合成也需要 NADPH作為輔酶還原乙酰乙酰輔酶A (圖3)，胞內(nèi)可利用的NADPH的量是影響PHB合成的重要因素。Lee等在含有R. eutropha PHB合成基因的重組大腸桿菌中研究了NADPH對(duì)PHB生物合成的調(diào)節(jié)作用，包括復(fù)合Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基加葡萄糖和化學(xué)培養(yǎng)基在內(nèi)的多種培養(yǎng)基被用于細(xì)菌培養(yǎng)，其中 LB加葡萄糖的培養(yǎng)基可以提供最高的[NADPH]/[NADH]，因此最利于PHB的積累[13-14]。在化學(xué)培養(yǎng)基中添加復(fù)合氮源、油酸或氨基酸等能夠明顯提高PHB的產(chǎn)量，由于氨基酸和油酸的生物合成需要消耗大量的還原力，因此重組大腸桿菌在化學(xué)培養(yǎng)基中生產(chǎn)PHB的效率與在復(fù)合培養(yǎng)基中相比要低很多[14]。

過表達(dá)磷酸戊糖途徑中產(chǎn)生NADPH的相關(guān)基因，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因 zwf和 6-磷酸-葡萄糖酸脫氫酶基因 gnd (圖 3)，能夠提高胞內(nèi)[NADPH]/[NADP]的水平，從而促進(jìn)PHB的合成，但是 NADPH濃度的提高抑制了檸檬酸合成酶的活性，使細(xì)胞生長(zhǎng)也受到了抑制[15]。調(diào)控磷酸戊糖途徑中非氧化階段的關(guān)鍵酶也能促進(jìn)PHB的合成，過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶基因talA使得重組大腸桿菌中PHB的含量由28.2%提高到了52.3%[16]，過表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶基因tktA可以使PHB的合成提高1.7倍[17]。

嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶可以催化氫在NAD和NADP之間的轉(zhuǎn)化 (圖 3)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝中起調(diào)控輔酶平衡的作用[18]。在重組大腸桿菌中過表達(dá)嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因udhA，能有效地提高PHB的產(chǎn)量，搖瓶實(shí)驗(yàn)中，31 h培養(yǎng)后，過表達(dá)udhA的重組菌中PHB的產(chǎn)量為6.42 g/L，而對(duì)照菌僅為3.52 g/L[19]。NAD激酶催化NAD的磷酸化生成NADP，是胞內(nèi)NADP的唯一來源 (圖3)。Li等[20]的研究表明，在含有PHB合成途徑的重組大腸桿菌中，過表達(dá)NAD激酶基因yfjB能夠有效地提高胞內(nèi)輔酶NADP的水平，搖瓶實(shí)驗(yàn)中，胞內(nèi)NADP的濃度提高了1.6～5.2倍。NADP濃度的提高促進(jìn)了PHB的合成，6 L的發(fā)酵罐培養(yǎng)中，P3HB的產(chǎn)量提高了100%，碳源轉(zhuǎn)化率提高了76%。

圖3 重組大腸桿菌中PHB生物合成的輔因子代謝調(diào)控Fig. 3 Cofactor engineering of PHB synthesis in recombinant E. coli. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; Zwf: glucose-6-P dehydrogenase; Gnd: 6-P-gluconate dehydrogenase; UdhA: pyridine nucleotide transhydrogenase; YfjB: NAD kinase.

2.2 短鏈中長(zhǎng)鏈共聚PHA的生產(chǎn)

Pseudomonas sp. 61-3和Pseudomonas stutzeri 1317的PHA合酶PhaC161-3和PhaC2Ps具有較低的底物特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)不同鏈長(zhǎng)的單體的聚合，得到短鏈中長(zhǎng)鏈共聚PHA[21-22]。在PHA合成缺陷突變株R. eutropha PHB-4中表達(dá)phaC2Ps基因，重組菌可以合成單體組成包括C4～C12的scl-mcl PHA，占細(xì)胞干重的 15%～41%。利用葡萄糖酸鈉和脂肪酸混合碳源培養(yǎng)，通過控制脂肪酸的添加，可以有效調(diào)節(jié)scl-mcl PHA的單體組成，使3HB單體比例能夠在16～100 mol%之間進(jìn)行調(diào)控。

在R. eutropha PHB-4中表達(dá)A. caviae的phaC基因，得到的重組菌能夠以豆油為碳源高效地生產(chǎn)PHBHHx，其中3HHx單體含量為5 mol%，細(xì)胞干重為123～138 g/L，PHBHHx含量高達(dá)71%～74%，由豆油生產(chǎn)PHA的轉(zhuǎn)化率為0.72～0.76[23]。

A. hydrophila 4AK4野生菌可以利用脂肪酸氧化途徑合成PHBHHx，為了獲得不同單體比例的PHBHHx，并提高菌株生產(chǎn) PHA的能力，針對(duì)其PHA合成途徑進(jìn)行了一系列代謝工程改造。在A. hydrophila 4AK4中表達(dá)來源于A. caviae的phaP或phaC基因能提高菌體內(nèi)PHBHHx含量和3HHx單體比例[24]。表達(dá)來源于R. eutropha的phaAB基因可以將胞內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A用于PHA合成，提高從脂肪酸到 PHA的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提高PHBHHx中 3HB單體比例[25]。異源表達(dá)透明顫菌Vitreoscilla編碼血紅蛋白的 vgb基因可以提高細(xì)胞對(duì)氧的利用率，從而提高細(xì)胞干重和 PHBHHx含量[26-27]。

2.3 新型PHA材料的生產(chǎn)

2.3.1 高HDD含量PHA的生產(chǎn)

P. putida能夠利用月桂酸合成含C6～C12單體的mcl PHA，敲除fadB和fadA基因可以弱化其β氧化途徑，從而使碳源更多地流向 PHA的合成，提高PHA含量、提高碳源轉(zhuǎn)化率和改變PHA的單體組成。Ouyang等[28]構(gòu)建了 fadB和 fadA敲除突變株P(guān). putida KTOY06，采用兩步法培養(yǎng)，在搖瓶中達(dá)到5.31 g/L的細(xì)胞干重，其中PHA含量達(dá)到細(xì)胞干重的84.3%，單體組成中的HDD成分為40.9 mol%，是野生菌的5倍左右。

2.3.2 高HHx含量PHA的生產(chǎn)

A. hydrophila 4AK4 利用月桂酸合成的PHBHHx中3HHx比例在20 mol%以下，通過敲除內(nèi)源的 PHA合酶基因，表達(dá)異源 PHA合酶基因phaC1ps、脂酰輔酶A合酶基因fadDec和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 fadLpp，構(gòu)建的重組菌可以利用己酸鈉為碳源，積累占細(xì)胞干重54%的PHBHHx，其中3HHx比例為95 mol%；以辛酸鈉為碳源培養(yǎng)時(shí)，重組菌積累占細(xì)胞干重51%的三元共聚物 PHBHHxHO，其中3HHx比例為82 mol%[29]。

2.3.3 PHV和PHHp的生產(chǎn)

Shen等[30]用戊酸、庚酸、壬酸和十一酸等奇數(shù)碳脂肪酸培養(yǎng)A. hydrophila 4AK4，發(fā)現(xiàn)其能利用十一酸合成聚 3-羥基戊酸酯 (Polyhydroxyvalerate，PHV)，采用兩步法搖瓶培養(yǎng)，在第二步中添加8 g/L的十一酸，細(xì)菌能達(dá)到5 g/L的細(xì)胞干重，PHV含量超過45%。Wang等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，fadBA敲除突變株P(guān). putida KTOY06可以利用庚酸鹽合成聚3-羥基庚酸酯 (Polyhydroxyheptanoate，PHHp)，在礦物鹽培養(yǎng)基中，添加10 g/L庚酸鹽為碳源，細(xì)菌能夠達(dá)到3.7 g/L的細(xì)胞干重，PHHp含量超過71%。

2.4 利用單一糖類碳源生產(chǎn)PHA共聚酯

通常情況下，3HB以外的PHA單體的聚合需要相關(guān)碳源的添加，例如4HB單體的聚合需要4-羥基丁酸或1,4-丁二醇等，3HV單體的聚合需要丙酸或戊酸，mcl 3HA單體的聚合需要脂肪酸或烷烴。這類相關(guān)碳源的價(jià)格普遍比糖類碳源貴很多，且對(duì)細(xì)胞毒性較大，發(fā)酵過程中需要以分批補(bǔ)料的方式添加，操作較為繁瑣。以相對(duì)廉價(jià)的簡(jiǎn)單糖類碳源來生產(chǎn)PHA共聚酯，將能有效地降低其生產(chǎn)成本，促進(jìn)PHA材料的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用開發(fā)，因此引起了很多研究者的興趣，目前取得的一些進(jìn)展見表1。

表1 利用簡(jiǎn)單碳源生產(chǎn)PHA共聚酯的研究Table 1 Metabolic engineering of microorganisms for production of PHA from simple carbon sources

2.4.1 利用葡萄糖生產(chǎn)P3HB4HB

Valentin等[38]通過在大腸桿菌中異源表達(dá) R. eutropha的 PHB合成操縱子 phaCAB和克氏梭菌Clostridium kluyveri的琥珀酸降解相關(guān)基因sucD、4hbD和orfZ，構(gòu)建出能夠利用葡萄糖生產(chǎn)P3HB4HB的基因工程菌 (圖4)。在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，重組菌能夠積累超過細(xì)胞干重50%的P3HB4HB，4HB單體含量為2.8 mol%，但細(xì)胞干重處于較低的水平。Li等[32]同樣利用上述代謝途徑，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因 sad和gabD 進(jìn)行敲除 (圖 4)，獲得了更高的細(xì)胞干重和4HB單體含量。在6 L的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過32 h的培養(yǎng)，細(xì)胞干重達(dá)到24.7 g/L，含有62.0%的P (3HB-co-12.1 mol% 4HB)。熱力學(xué)及材料力學(xué)性質(zhì)的研究表明，與PHB相比，P3HB4HB共聚酯的結(jié)晶度下降，斷裂伸長(zhǎng)率提高，表現(xiàn)出明顯的彈性體的特點(diǎn)。

圖4 利用葡萄糖為碳源在重組大腸桿菌中合成P3HB4HBFig. 4 P3HB4HB producing pathway in recombinant E. coli cultivated with glucose as carbon source. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; SucD: succinate semialdehyde dehydrogenase; 4HbD: 4HB dehydrogenase; OrfZ: 4HB-CoA:succinyl-CoA CoA transferase; Sad and GabD: non-CoA acylating succinate semialdehyde dehydrogenase of E. coli.

2.4.2 利用甘油生產(chǎn)PHBV

大腸桿菌中存在sbm-ygfD-ygfG操縱子，能夠催化琥珀酰輔酶 A生成丙酰輔酶 A，腸道沙門氏菌Salmonella enterica中prpC基因催化丙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成 2-甲基檸檬酸。Aldor等[33]通過在prpC突變的S. enteric JE4199中表達(dá)sbm-ygfD-ygfG和不動(dòng)桿菌 Acinetobacter 的 PHB合成操縱子phbBCA，實(shí)現(xiàn)了由甘油來生產(chǎn)PHBV，其中3HV單體含量為14 mol%，PHBV達(dá)細(xì)胞干重的40%以上。

2.4.3 利用簡(jiǎn)單碳源生產(chǎn)短鏈中長(zhǎng)鏈共聚PHA

Taguchi等[22,34]在R. eutropha PHB-4中表達(dá)源自Pseudomonas sp. 61-3的phaG和phaC1基因，重組菌可以利用果糖合成短鏈中長(zhǎng)鏈共聚的PHA，其中3HB單體含量為95～97 mol%，在此基礎(chǔ)上表達(dá)R. eutropha的phbAB基因使得PHA含量由26%提高到 43%[22,34]。將肉桂地鏈霉菌 Streptomyces cinnamonensis的ccr基因以及A. caviae的phaCJ基因?qū)隦. eutropha PHB-4中，得到的重組菌能夠利用果糖合成占細(xì)胞干重48%的PHBHHx，其中3HHx單體含量為1.5 mol%，共聚物中的 C6前體是通過PhaA催化的丁酰輔酶A延伸合成的，ccr基因起了催化巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A的作用[36]。

在一般培養(yǎng)中，A. hydrophila 4AK4野生菌不能利用糖類碳源合成PHBHHx或者PHB，將來源于大腸桿菌、刪除了前導(dǎo)序列的編碼硫酯酶I的tesA基因?qū)階. hydrophila 4AK4，重組菌可以利用葡萄糖酸鈉合成PHBHHx，通過限磷或限氮可使PHBHHx含量提高到10%，3HHx含量為14 mol%[35]。在P. putida GPp104中表達(dá) R. eutropha的 phaB、A. hydrophila的phaC以及本身的phaG基因，得到的重組菌可以用葡萄糖合成PHBHHx，其含量最高可達(dá)19%，其中3HHx含量為5 mol%[35]。

Ouyang等[37]刪除了P. putida KT2442的PHA合成操縱子的大部分序列，獲得了一株P(guān)HA合成功能喪失的突變株P(guān). putida KTOY01，在其中表達(dá)底物特異性較低的 phaC2Ps基因以及 R. eutropha的phbAB基因，得到的重組菌株可以在以葡萄糖為碳源的搖瓶培養(yǎng)基中獲得2.37 g/L的細(xì)胞干重，PHA含量為22.8%，其中含88 mol% HB和12 mol%中長(zhǎng)鏈單體。

3 微氧條件下生產(chǎn)PHB的研究

在不影響產(chǎn)物形成的情況下，降低細(xì)菌發(fā)酵過程中的氧氣供給能夠減少發(fā)酵工業(yè)中最大的能量消耗——通氧攪拌。無氧發(fā)酵可以生產(chǎn)多種產(chǎn)品，如乙醇、乳酸和琥珀酸等，但是在無氧環(huán)境下生產(chǎn)PHB是非常困難的，因?yàn)楝F(xiàn)有的PHB生產(chǎn)菌種都是好氧生長(zhǎng)菌，在氧氣供應(yīng)不足時(shí)菌體生長(zhǎng)難以維持。有些實(shí)驗(yàn)室嘗試?yán)脽o氧發(fā)酵來產(chǎn)生PHB，希望能夠有所突破，但是尚未取得明顯的效果[39]。目前，一些研究者的眼光逐漸由無氧生產(chǎn)轉(zhuǎn)向了微氧生產(chǎn)。相比好氧發(fā)酵，微氧發(fā)酵有著培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)規(guī)模容易擴(kuò)大的優(yōu)點(diǎn)，而且微氧培養(yǎng)也無需像嚴(yán)格厭氧發(fā)酵那樣需在氮?dú)獗Ｗo(hù)等輔助手段下進(jìn)行，因此在生產(chǎn)上更為簡(jiǎn)單易行，對(duì)設(shè)備的要求也更低。

Alexeeva等在敲除了 ArcA的大腸桿菌突變體中發(fā)現(xiàn)，在充分好氧或嚴(yán)格厭氧的情況下菌體的代謝水平并沒有發(fā)生變化，但敲除ArcA卻能明顯提高細(xì)菌在微氧環(huán)境中的呼吸作用，同時(shí)菌體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也有改變[40]。Nikel等嘗試使用AcrA突變的重組大腸桿菌在微氧條件下合成PHB，取得了一定效果[41]，在微氧條件下，通過分批補(bǔ)料的方式添加甘油為碳源，60 h的培養(yǎng)獲得了10.8 g/L的PHB產(chǎn)量[42]。

Wei等[43]將厭氧啟動(dòng)子引入到 PHB的微氧生產(chǎn)，以解除菌體在微氧環(huán)境下PHB合成基因不能正常表達(dá)的問題。經(jīng)過檢索分析篩選出 9個(gè)厭氧啟動(dòng)子作為候選，通過實(shí)驗(yàn)比較從中找到了微氧條件下具有較高活性的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子 PadhE，將 PadhE應(yīng)用于微氧PHB的生產(chǎn)，使得菌體中PHB的含量從30%提高到了48%。研究還發(fā)現(xiàn)改變菌體代謝流能夠提高PadhE的活性，將PadhE應(yīng)用于乙酸缺失突變體E. coli JW2293和JW2294中，在微氧條件下，兩株突變體比野生型顯示了更高的 PHB合成能力，PHB的含量分別達(dá)到了58%和67%[43]。

4 PHA合成基因作為代謝調(diào)控的因子提高工業(yè)生產(chǎn)菌的代謝潛能

4.1 PHA的合成提高微生物的抗逆性

PHA的合成與細(xì)菌的抗逆性之間存在著密切的聯(lián)系，微生物積累PHA能夠增加其在多變環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)能力。例如PHB在碳源過剩以及氮、磷等營養(yǎng)缺乏時(shí)合成，可以作為碳源和能源的儲(chǔ)存物；當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，PHB可以使得細(xì)胞的生存時(shí)間延長(zhǎng)，從而渡過難關(guān)。López等[44-45]的研究發(fā)現(xiàn)，在惡劣的環(huán)境下PHB野生菌R. eutropha比其PHB積累缺陷菌有更強(qiáng)的耐受能力。在固氮菌中，PHB的積累還可作為調(diào)節(jié)細(xì)菌生存環(huán)境中氧含量的因子，也可用作電子供體，賦予細(xì)菌在生命進(jìn)化過程中更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力[44]。

Zhao等[46]利用能生產(chǎn)共聚物 PHBHHx的A. hydrophila 4AK4野生菌和不產(chǎn)PHBHHx的PhaC突變株A. hydrophila CQ4作比較來研究PHA合成的抗性原理，發(fā)現(xiàn)野生菌 4AK4對(duì)各種環(huán)境因子包括高溫、低溫、紫外照射、有機(jī)溶劑、高滲透壓和過氧化氫等的抗逆性均高于突變菌 CQ4。分子水平上檢測(cè)rpoS表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，較高的存活率與較高水平的rpoS表達(dá)量相偶聯(lián)，在環(huán)境因子的刺激下，細(xì)菌內(nèi)PHBHHx的存在會(huì)增強(qiáng)胞內(nèi)包括rpoS在內(nèi)的基因的表達(dá)，而rpoS的表達(dá)則會(huì)與RNA聚合酶結(jié)合激活各種壓力蛋白的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)菌免受環(huán)境壓力的毒害。

4.2 PHA合成基因在工業(yè)微生物中的應(yīng)用

PHA在細(xì)菌內(nèi)的積累主要有兩方面的影響，一是作為碳源和能源的儲(chǔ)存物，二是消耗還原型輔酶，避免其積累對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。PHA的合成消耗掉了胞內(nèi)的代謝資源，使整個(gè)碳源和能源的分布發(fā)生了很大的變化，由此可推測(cè)PHA合成途徑可以改變胞內(nèi)的整體代謝調(diào)節(jié)，對(duì)微生物的其他新陳代謝也產(chǎn)生了影響。PHA合成基因在工業(yè)微生物菌株中的表達(dá)，可以從整體上調(diào)控微生物的代謝，從而提高含PHA基因重組菌的產(chǎn)品產(chǎn)率。

4.2.1 PHA的合成對(duì)谷氨酸棒桿菌中谷氨酸合成的影響

Liu等[47]通過優(yōu)化基因表達(dá)，成功地在幾株谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum中表達(dá)R. eutropha的PHB合成基因phbCAB，搖瓶培養(yǎng)中積累PHB的重組菌的谷氨酸產(chǎn)量分別提高了17%～39%，發(fā)酵罐培養(yǎng)中，含有 phbCAB的重組 C. glutamicum ATCC14067與野生菌株相比，細(xì)胞干重提高10%，葡萄糖的消耗增加13%，谷氨酸的產(chǎn)量則提高23%。由于PHB合成基因的引入，使得胞內(nèi)NADPH的水平下降，細(xì)胞為了增加 NADPH的合成，更多的代謝流流向了糖酵解途徑和TCA循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)了谷氨酸的合成；同時(shí)由于PHB合成對(duì)碳源的分流，減少了副代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量。

圖5 PHB合成基因在獸疫鏈球菌中表達(dá)提高透明質(zhì)酸生產(chǎn)Fig. 5 Expression of PHB synthesis genes in Streptococcus zooepidemicus improved hyaluronic acid production.

4.2.2 PHA的合成提高獸疫鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力

在獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過程中，大量的碳源流向乳酸的合成，高濃度的乳酸抑制了菌體的生長(zhǎng)和透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。在發(fā)酵罐的低溶解氧條件下，生成乳酸是細(xì)胞再生NAD的主要途徑，Zhang等[48]通過在獸疫鏈球菌中表達(dá)R. eutropha的phbCAB基因，提供了另一條獲得氧化力的途徑，使乳酸的產(chǎn)量由64 g/L下降到41 g/L，同時(shí)增加了透明質(zhì)酸的合成 (圖5)。

4.2.3 PHA的合成對(duì)移動(dòng)單胞菌中乙醇生產(chǎn)的影響

Lai等[49]在移動(dòng)單胞菌Zymomonas mobilis中表達(dá)R. eutropha的PHB合成基因并實(shí)現(xiàn)了PHB的積累，48 h的搖瓶培養(yǎng)表明，PHB的積累對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡萄糖利用和乙醇合成產(chǎn)生了影響，帶有PHB合成基因表達(dá)質(zhì)粒的重組菌的乙醇生產(chǎn)量比野生菌提高了約10%，說明PHB的積累能夠在一定程度上提高了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇生產(chǎn)能力。

5 結(jié)論與展望

聚羥基脂肪酸酯 (PHA) 是一類材物化性能多樣的生物可降解聚合物，在很多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用價(jià)值，具有非常好的發(fā)展前景。過去幾十年中對(duì)于PHA合成機(jī)制和代謝途徑的深入研究使得我們能夠構(gòu)建出各種生產(chǎn)PHA的基因工程菌，這些基因工程菌的生產(chǎn)能力比天然的生產(chǎn)菌株要強(qiáng)很多。合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等的迅速發(fā)展提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，將其應(yīng)用于PHA代謝工程領(lǐng)域，會(huì)有利于我們構(gòu)建更為高效的PHA生產(chǎn)菌，降低PHA材料的生產(chǎn)成本，推動(dòng)其工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)，促進(jìn)塑料產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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