徐友強，馬翠卿，陶飛，許平

1 山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100

2 上海交通大學 微生物代謝教育部重點實驗室，上海 200240

細菌啟動子識別及應用研究進展

徐友強1，馬翠卿1，陶飛2，許平2

1 山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100

2 上海交通大學 微生物代謝教育部重點實驗室，上海 200240

細菌啟動子是細菌中基因表達的必需調(diào)控元件，決定了細菌基因表達的強度和時機。通過啟動子的插入或缺失，可以改變細菌基因的表達，實現(xiàn)對菌體生長發(fā)育以及代謝調(diào)控的研究。啟動子也是構(gòu)建各種表達系統(tǒng)、實現(xiàn)異源基因表達的基礎(chǔ)。啟動子的識別和應用研究，對于實現(xiàn)異源基因的可控表達、有效獲得目的產(chǎn)物、促進生物催化和代謝工程研究具有重要的意義。以下對細菌啟動子進行了簡單的介紹，總結(jié)了細菌啟動子的識別方法，并對細菌啟動子的研究進展和具體應用進行了概述。

啟動子識別，誘導型啟動子，啟動子應用

隨著DNA測序技術(shù)的進步，越來越多的細菌基因組被測序，為啟動子識別和應用提供了材料，大量啟動子的發(fā)現(xiàn)及應用，推動了生物催化技術(shù)的發(fā)展。本文對細菌啟動子進行了簡單的介紹，對其識別方法進行了總結(jié)，并對細菌啟動子的研究和具體應用進展進行了概述。

1 細菌啟動子簡介

細菌啟動子是指可與 RNA聚合酶結(jié)合以起始基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列區(qū)域。細菌啟動子的結(jié)構(gòu)一般包括?35區(qū)、?10區(qū)、?35區(qū)和?10區(qū)之間的區(qū)域以及轉(zhuǎn)錄起始位點 (Transcription start site，TSS)，其中，?35區(qū)位于起始轉(zhuǎn)錄區(qū)上游35 bp附近，一般為6個堿基，其序列一般為TTGACA，詳細形式為：T82T84G78A65C54A45(下標表示最大頻率出現(xiàn)堿基對應的百分數(shù))[2]，可以與RNA聚合酶結(jié)合從而起始轉(zhuǎn)錄[3-4]。?10區(qū)位于起始轉(zhuǎn)錄區(qū)上游10 bp附近，一般為6個堿基，序列一般為TATAAT，詳細形式為：T80A95T45A60A50T96(下標表示最大頻率出現(xiàn)堿基對應的百分數(shù))[2]，其序列也與RNA聚合酶結(jié)合從而起始轉(zhuǎn)錄有關(guān)，又叫Pribnow盒子 (Pribnow box)[3-4]。除此之外，一些細菌啟動子還有特殊結(jié)構(gòu)，如 UP元件、轉(zhuǎn)錄起始位點下游A/T富集區(qū)和延伸?10區(qū)。前者是指一段富含A/T堿基的序列，位于?35區(qū)上游，一般為轉(zhuǎn)錄起始位點上游40~60 bp范圍的富含A/T的區(qū)域，與RNA聚合酶的α亞基的C端終止域結(jié)合[5-6]，其序列分為 2個部分：轉(zhuǎn)錄起始位點上游41~44 bp位置的AAAA和轉(zhuǎn)錄起始位點上游47~57 bp位置的AAA(A/T)(A/T)T(A/T)TTTT。轉(zhuǎn)錄起始位點的下游存在周期分布的A/T富集區(qū)域，主要集中在 6±3、23±3、40±2、56±2等位置[7]。延伸?10區(qū)是指位于?10區(qū)上游的幾個堿基，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游 13~17 bp處，序列一般為TGTGN[8]，可以與RNA聚合酶結(jié)合，有利于RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄?？梢钥闯?，細菌啟動子的保守序列在核心區(qū)域中按一定規(guī)律分布，彼此存在一定間隔。這使得各個區(qū)域均保持在雙螺旋的同一側(cè)，從而有利于與RNA聚合酶相結(jié)合。但RNA聚合酶并不能直接與啟動子DNA序列相結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄[9]，而是需要σ因子的輔助，形成RNA聚合酶全酶，才能與啟動子DNA序列相結(jié)合[10]。

細菌的σ因子分為2個大類，σ70家族和σ54家族[11]。其中，σ70家族存在于幾乎所有細菌中，σ70家族大部分成員一般含有 4個結(jié)構(gòu)域：σ1、σ2、σ3和σ4，其中，σ2有利于RNA聚合酶β’亞基與啟動子?10區(qū)結(jié)合，σ4有利于RNA聚合酶β亞基與啟動子?35區(qū)結(jié)合[12]。σ54家族成員與 σ70相比，在氨基酸序列和轉(zhuǎn)錄機制上均有不同[13]，其存在也不如σ70家族廣泛，已知研究發(fā)現(xiàn)在于變形菌中，它與氮源代謝的調(diào)控相關(guān)[13]；在枯草芽胞桿菌中，它與精氨酸和鳥氨酸利用的調(diào)控[14]以及果糖轉(zhuǎn)運有關(guān)[15]。另外，基因組測序顯示，σ54因子還存在于其他菌，如極度嗜熱菌、專性細胞內(nèi)病原體、螺旋菌和綠色硫細菌中[16]。σ54家族具有一些特殊的調(diào)控特性，如起始轉(zhuǎn)錄需要同源激活蛋白，使該起始轉(zhuǎn)錄具有嚴謹調(diào)控性且本底表達很低[17]。σ54-RNA聚合酶復合體行使功能需要較長的基因間隔序列等[18]。

除此之外，還有一些特殊的σ因子，分別行使特定的不同功能，如與細菌環(huán)境壓力反應和細菌生長穩(wěn)定期相關(guān)的σs因子；與細胞質(zhì)熱反應相關(guān)的σ32因子 (又名σH因子)；與細菌饑餓反應和鞭毛合成相關(guān)的 σ28因子 (又名σF因子)；與細菌胞膜壓力反應相關(guān)的σE因子等[19]，在此不再贅述。

由于細菌啟動子在生物催化中的重要作用，目前對細菌啟動子研究的工作非常多。本文首先對細菌啟動子的識別方法作一概括。

2 細菌啟動子識別方法

細菌啟動子識別在啟動子研究中起著重要作用。識別和發(fā)現(xiàn)新的啟動子，對細菌啟動子的研究具有重要的意義，可以提供具有不同啟動強度、不同宿主適用范圍等特點的啟動子，滿足生物催化技術(shù)的各種要求，促進生物催化技術(shù)的發(fā)展。細菌啟動子識別的目的是對已測序的細菌基因組的部分或全部進行分析，從而識別出啟動子的核心區(qū)域。在識別的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他的實驗方法，可以對細菌啟動子進行進一步的驗證。隨著啟動子識別研究的深入，出現(xiàn)了許多啟動子識別的方法，概要介紹如下。

2.1 基于結(jié)構(gòu)特征進行的細菌啟動子識別

細菌啟動子具有多種共同的特征，如低穩(wěn)定性(Stability)、高彎曲率 (Curvature)、低的可彎曲性(Bendability)等[20-23]，這為細菌啟動子的預測提供了線索。

Kanhere等[24]研究發(fā)現(xiàn)，啟動子所在區(qū)域與細菌基因組的其他區(qū)域相比更加不穩(wěn)定，易發(fā)生熔解，從而有利于RNA的轉(zhuǎn)錄。在此基礎(chǔ)上對大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和谷氨酸棒桿菌的啟動子進行了識別，分別發(fā)現(xiàn)了227、89和28個啟動子，他們認為該方法有很好的應用性，并且如果將該方法與啟動子的其他特征相結(jié)合會大大改善啟動子序列的識別。

Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)細菌基因組有一些區(qū)域在超螺旋壓力下非常不穩(wěn)定，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，這些區(qū)域與含有啟動子序列的基因間區(qū)域有關(guān)。他們將這一發(fā)現(xiàn)結(jié)合啟動子已知的結(jié)構(gòu)和序列特征，進行了啟動子的識別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，壓力誘導型DNA復式不穩(wěn)定 (Stress-induced DNA duplex destabilization，SIDD) 與特定的啟動子區(qū)域有關(guān)。在E. coli K12的基因組序列中，與啟動子DNA的其他特性如?10區(qū)的彎曲、形變、熱穩(wěn)定性或是序列結(jié)構(gòu)域相比，SIDD在啟動子識別上具有非常高的準確率 (高于80%)。除此之外，該方法也可用于枯草芽胞桿菌，識別準確率也高于80%。

Towsey等[26]將DNA的結(jié)構(gòu)特征與基于計算機的識別方法相結(jié)合，建立了一個新的啟動子識別方法。他們將壓力誘導型復式不穩(wěn)定 (SIDD)、DNA螺旋和折疊能量等參數(shù)結(jié)合在一起，以期能夠建立一個完善的啟動子識別方法。然而他們發(fā)現(xiàn)，啟動子啟動基因表達的相關(guān)特性并不是一成不變的，所以不可能建立啟動子的完美的識別模型。

以上啟動子識別方法的特異性并不是很高，但啟動子的這些特征可以方便地與啟動子其他的識別方法結(jié)合，使其具有潛在的應用性。

2.2 基于細菌啟動子在基因組中的分布特征進行的啟動子識別

細菌啟動子在基因組中的分布并不是雜亂的，而是有一定的規(guī)律可循。在細菌中，σ因子和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白識別啟動子DNA序列，然后與RNA聚合酶結(jié)合啟動基因轉(zhuǎn)錄。進化導致了轉(zhuǎn)錄因子識別的 DNA序列在細菌基因組的編碼區(qū)之間比較密集，而在編碼區(qū)則不常見。據(jù)此，可以進行啟動子的識別。

Jacques等[27]研究發(fā)現(xiàn)細菌基因組中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的分布傾向于編碼區(qū)之間的區(qū)域，而且這一傾向存在于大部分的細菌中。在該發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，他們建立了一個比直接的序列比對更有效的啟動子識別方法。這一方法可以很容易地與其他的識別方法結(jié)合使用，而且可以同時用于對多個細菌基因組的分析。

由于細菌啟動子的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域基因序列有固定的規(guī)律，Gordon等[28]以轉(zhuǎn)錄起始位點 (Transcription start site，TSS) 為基礎(chǔ)，利用計算機建立了一個算法。利用該算法，繪制了一幅大腸桿菌基因組的啟動子圖譜。盡管該方法并不是很嚴謹，但卻是一個自動的基因組水平上的啟動子識別方法，簡化了啟動子識別的途徑。

盡管此類方法比較簡單，而且可以快速高效地識別啟動子，但是該類方法是建立在細菌基因組經(jīng)過系統(tǒng)注釋的基礎(chǔ)上的，故應用范圍受到限制。

2.3 計算機建模方法進行的細菌啟動子識別

細菌啟動子序列與基因組 DNA相比存在較明顯的特征，因此最直接的方法就是把啟動子序列看成一種整體信號，直接用各種模式發(fā)現(xiàn)的方法進行識別。常用的方法有人工神經(jīng)網(wǎng)絡 (Artificial neural network，ANN)[29]、隱馬爾可夫模型 (Hidden markov model，HMM)[30]等，還有研究將以上模型與啟動子已知的特征相結(jié)合進行啟動子的識別，具體介紹如下。

Tavares等[31]利用幾種機器學習算法建立了對大腸桿菌基因組中啟動子的識別方法。他們系統(tǒng)地比較了 Bayes (CNB；Na?ve Bayes；Na?ve Bayes Simple；NaiveBayesUpdateable；AODE)、Neural Net (Multiplayer Perceptron；SMO；RBF Network；Logistic；Voted Perceptron)、Meta (Logit Boost；MultiBoost AB；MultiClass Classifier；Threshold Selector；ADA Boost)、Trees (NBTree；LMT；ADTree；J48；ID3)、Lazy (LBR；IB1；Kstar；IBk；LWL) 和Rules (PART；Decision table；Ridor；JRip；NNge) 模型。經(jīng)過比較，他們發(fā)現(xiàn)以概率和神經(jīng)網(wǎng)絡系統(tǒng)為基礎(chǔ)的算法具有更高的準確性。在細菌啟動子識別中可以有選擇地使用這些模型，也可以互相搭配使用這些模型。

Du等[32]基于特征選擇的二次方程判別式分析方法 (Quadratic discriminant analysis，QDA) 進行細菌啟動子的識別，并且將啟動子DNA的序列特征、信號特征、結(jié)構(gòu)特征等與二次方程判別式分析方法相結(jié)合，建立了一個啟動子識別模型，并將該模型用于大腸桿菌啟動子的識別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非編碼區(qū)的識別成功率為 85.7%，編碼區(qū)的識別成功率也接近80%。這一結(jié)果表明該算法是很有價值的一個啟動子識別方法。他們還將該算法應用于枯草芽胞桿菌，發(fā)現(xiàn)啟動子的識別成功率也在80%左右，這說明該方法具有較為廣泛的適用性。

Reis等[33]以隱馬爾可夫模式、閾值決定評估和辨別分析為基礎(chǔ)，建立了一個細菌啟動子識別方法，并將該方法應用于細菌基因組的啟動子識別，結(jié)果與以前的工作相比，對大腸桿菌的啟動子識別錯誤率下降了44.96%，對枯草芽胞桿菌的啟動子識別準確率和成功率分別為95%和78%，但對幽門螺旋桿菌的啟動子識別成功率并不高。這說明該算法具有較高的啟動子識別準確率和成功率，但適用范圍并不廣泛。

Dekhtyar等[34]建立了一個三維的強啟動子識別模型，該模型可用于已注釋的細菌基因組啟動子預測，它與特定的大腸桿菌的I型RNA聚合酶σ70因子相匹配。它是通過將序列依次匹配3個條件來進行預測的，這 3個條件依次是：含有 UP-元件；需要與α亞基作用；具有明顯可以區(qū)分的?35區(qū)和?10區(qū)，以與RNA聚合酶的σ70亞基相互作用。利用該模型對 43個細菌基因組進行了強啟動子的識別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該三維強啟動子識別模型適于細菌基因組 A+T含量在 62%以下的細菌基因組的強啟動子識別。

總而言之，計算機建模方法首先根據(jù)已有的信息選擇結(jié)構(gòu)模型，然后用已知的序列數(shù)據(jù)作為訓練集，通過相應的訓練算法，進行訓練得到模型參數(shù)。此類方法對訓練算法、模型參數(shù)的初值以及閾值都很敏感。雖然一些模型如神經(jīng)網(wǎng)絡模型和馬爾可夫模型可以分別通過增加神經(jīng)網(wǎng)絡的層數(shù)和馬爾可夫鏈的階次來提高模型復雜度，但由于利用的信息太寬泛，導致假陽性較多，識別準確率較低。

2.4 利用 RNA聚合酶的特殊亞基進行細菌啟動子的預測

利用計算機來進行細菌啟動子的識別并沒有有效的利用啟動子的轉(zhuǎn)錄特性，這意味著通常的啟動子識別方法可能并不完善。細菌啟動子啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄通常必須是在 RNA聚合酶及其輔因子的共同調(diào)控下進行，利用這一特征可以有效準確地進行啟動子識別。

Nakano等[35]利用Spx和RNA聚合酶α亞基C-端復合體進行啟動子識別。Spx是砷酸鹽還原酶家族的成員，是微生物壓力反應的通用轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在革蘭氏陽性菌中高度保守。他們研究發(fā)現(xiàn)，Spx和 αCTD形成一個復合體，該復合體可以識別 Spx調(diào)控基因的啟動子DNA。當Spx氧化成二硫化構(gòu)型時，Spx的α螺旋 (α4) 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而α4含有具有轉(zhuǎn)錄起始功能以及和 αCTD/Spx-啟動子結(jié)合的殘基。根據(jù)這一結(jié)合特性，可以準確地識別啟動子序列。

這一方法準確度高，但由于實驗的復雜性及該現(xiàn)象的局限性，使其應用具有很大的限制，但卻是對上述識別方法的一個很好的補充。

3 細菌啟動子研究和應用進展

細菌表達系統(tǒng)研究中涉及到的啟動子有很多種，大致可以分為誘導型啟動子和組成型啟動子兩大類。其中，細菌表達系統(tǒng)中常用的誘導型啟動子有l(wèi)ac啟動子 (乳糖啟動子)、trc和tac啟動子 (乳糖和色氨酸的雜合啟動子)、T7噬菌體啟動子、L-阿拉伯糖誘導的 PBAD啟動子、L-鼠李糖誘導的rhaPBAD啟動子等，現(xiàn)分別介紹如下。

3.1 細菌常用誘導型啟動子研究進展

3.1.1 lac啟動子

它來自大腸桿菌的乳糖操縱子。乳糖操縱子是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因、啟動基因、操縱基因和編碼 3個與乳糖利用有關(guān)的酶的基因所組成[36]。lac啟動子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏物的負調(diào)控。正調(diào)控通過CAP (Catabolite gene activation protein) 因子和cAMP來激活啟動子，促進轉(zhuǎn)錄。負調(diào)控則是由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生LacZ阻遏蛋白，該阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄。

lac啟動子應用非常廣泛，分子生物學研究中常用的載體很多都含有 lac啟動子，可以加入誘導物IPTG以啟動目的基因的表達，但是該啟動子與 tac和trc啟動子相比，啟動效率較低，不利于目的蛋白的高效表達[37]。

3.1.2 tac和trc啟動子

tac啟動子是由lac啟動子和trp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子[38]，受LacI阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)，它的啟動能力比lac和trp都強[39]。其中tacI啟動子的?20到起始位點的區(qū)域來自trp啟動子，其余部分來自于lac UV5啟動子；tacII啟動子的?11到起始位點 (包括Pribnow盒子) 來自trp啟動子，其余部分由一個合成的46 bp DNA片段加上lac操縱子中的操縱基因和SD序列融合而成[38]。

trc啟動子也是由 trp啟動子和 lac啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，由lac UV5啟動子的?10區(qū)和trp啟動子的?35區(qū)構(gòu)成[37]，同樣具有比lac更高的轉(zhuǎn)錄效率[39]和受阻遏蛋白 LacI調(diào)控的強啟動子特性。trc啟動子的平均效率只有tac啟動子的90%[39]。這兩個啟動子均受IPTG誘導調(diào)節(jié)。

3.1.3 T7噬菌體啟動子

T7噬菌體啟動子具有高度的特異性，只有 T7 RNA聚合酶才能使其啟動，許多外源終止子都不能有效地終止T7 RNA聚合酶，因此它可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列，可以高效表達其他系統(tǒng)不能有效表達的基因，這使該啟動子成為目前應用最為廣泛的啟動子之一[40]。T7 RNA聚合酶與大腸桿菌RNA聚合酶相比，在轉(zhuǎn)錄時對DNA鏈的延伸效率要高數(shù)倍，使其可以很好地應用于E. coli BL21 (DE3) 表達宿主，因為E. coli BL21 (DE3) 宿主基因組上含有 T7 RNA聚合酶基因，該基因通過lac啟動子系列的L8-UV5 lac啟動子調(diào)控[41]。L8-UV5 lac啟動子因為含有突變位點而與野生型lac啟動子相區(qū)別。在它的?10區(qū)有2個位點的突變，這增強了它的啟動效率，并且降低了它對AMP循環(huán)的依賴，另外它還有一個位點的突變，這導致了該啟動子對葡萄糖的敏感性降低[41]，即在葡萄糖存在的情況下，T7 RNA聚合酶也可以被IPTG有效地誘導表達。但由于其啟動效率很高，如果表達的外源蛋白對宿主有毒害，則不利于外源基因的表達[42]。這也使得該啟動子在應用中存在一定的局限。

3.1.4 L-阿拉伯糖誘導的PBAD啟動子

L-阿拉伯糖誘導的PBAD啟動子來自于阿拉伯糖操縱子。阿拉伯糖操縱子是指令合成糖分解代謝所需酶系的操縱子，具有正、負調(diào)節(jié)的功能。它有 2個啟動子Pc和PBAD，可以雙向轉(zhuǎn)錄。

阿拉伯糖誘導的PBAD啟動子已經(jīng)被廣泛地用于大腸桿菌和其他宿主中表達異源基因[43-45]。當阿拉伯糖加入培養(yǎng)基后，它會與蛋白AraC結(jié)合，從而使結(jié)合于PBAD和PC之間araI1和araI2基因位置上的蛋白 AraC脫落下來[46]。當不存在阿拉伯糖時，蛋白AraC結(jié)合在PBAD和PC之間并不脫落下來，這一特性使araC-PBAD表達系統(tǒng)具有如下性質(zhì)：當阿拉伯糖不存在時只有很少量的本底表達，并且可以通過控制 L-阿拉伯糖的加入調(diào)控基因的表達水平。araC-PBAD表達系統(tǒng)調(diào)控基因表達時表現(xiàn)出的是一種全或無的調(diào)控特性[47]，即在沒有L-阿拉伯糖加入時不表達基因，而在低濃度L-阿拉伯糖加入時，只有部分細胞誘導表達，另一部分細胞不誘導表達，隨著L-阿拉伯糖濃度的增加，誘導表達的細胞比例增加，而且已被誘導表達的細胞表達強度并不隨L-阿拉伯糖的濃度變化而變化。

3.1.5 L-鼠李糖誘導的rhaPBAD啟動子

L-鼠李糖誘導的 rhaPBAD啟動子來源于鼠李糖調(diào)節(jié)子，該調(diào)節(jié)子包括啟動子PBAD及其控制的結(jié)構(gòu)基因rhaA、rhaB和rhaD，啟動子Pt及其控制的結(jié)構(gòu)基因rhaT，啟動子Psr及其控制的調(diào)節(jié)基因rhaS和 rhaR。L-鼠李糖誘導的 rhaPBAD啟動子是一個非常好的在大腸桿菌中嚴謹調(diào)控外源基因表達的工具。L-鼠李糖作為誘導物可以與蛋白RhaR一起誘導RhaS的合成，RhaS具有正調(diào)控鼠李糖調(diào)節(jié)子的功能[48]。

當環(huán)境中無 L-鼠李糖時，rhaSR雖存在一定數(shù)量的本底表達，但啟動子效率極低；當存在L-鼠李糖時，RhaR被活化結(jié)合到rhaSR操縱子的特定區(qū)域，并與CRP和RNA聚合酶的α-CTD (RNA聚合酶α亞基 C-端復合體) 相互作用起始自身的表達，同時表達RhaS。當RhaS積累到一定程度，就會結(jié)合到rhaBAD和 rhaT啟動子區(qū)的特定 DNA位點上與CRP、RNA聚合酶一起啟動基因的表達[49-50]。

表1 細菌常用誘導型啟動子特性總結(jié)Table 1 Summary of the characteristics of common bacterial promoters

除了這些常用的啟動子外，四環(huán)素誘導的 tetA啟動子也很常用。tetA啟動子常用于大腸桿菌高效且嚴謹調(diào)控外源基因的表達[51-52]。與其他表達系統(tǒng)相比，該表達系統(tǒng)在大腸桿菌中的本底表達量非常低，這也使其應用具有一定的優(yōu)勢。除了上述這些啟動子外，來自于TOL質(zhì)粒的調(diào)控甲苯代謝的啟動子[53]，來自于 NAH質(zhì)粒的調(diào)控萘代謝的啟動子[54]以及最近用于丙酸鹽代謝研究的啟動子[55-56]也得到了廣泛的應用。細菌誘導型啟動子的具體應用主要有以下4個方面：

3.2 細菌誘導型啟動子應用進展

3.2.1 細菌啟動子在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應用

這是細菌啟動子應用最為廣泛的方面。通過改造現(xiàn)有載體，插入不同的啟動子可獲得各種不同需要的載體，滿足不同蛋白質(zhì)生產(chǎn)的要求。

Skerra等[51]構(gòu)建了一個以大腸桿菌為宿主的含有 PtetA啟動子的嚴謹調(diào)控型的表達載體。通過低濃度無水四環(huán)素的加入即可方便地誘導外源基因的表達。并以重組小鼠免疫球蛋白Fab片段的生產(chǎn)作為實例，檢測了該系統(tǒng)的性能，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)功能的行使具有獨立性，不依賴于宿主，而且在沒有誘導物時無本底表達，是一個很好的IPTG誘導的啟動子系統(tǒng)的替代系統(tǒng)，在異源基因表達方面具有很大的應用前景。

Lee等[56]構(gòu)建了可應用于大腸桿菌的pPro系列的表達載體，pPro載體含有prpBCDE啟動子，通過在啟動子后插入綠色熒光蛋白基因gfp，檢測了該系統(tǒng)的效率和調(diào)控特性。這一系列的表達系統(tǒng)在沒有丙酸鹽存在的條件下本底表達很低，在丙酸鹽存在的條件下是可控表達的，而且在高濃度丙酸鹽存在的條件下具有很高的表達強度，這些特征使該系列的載體在蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)領(lǐng)域中具有很大的應用前景。

黃素 c-硫化脫氫酶 (Flavcytochrome c-sulfide dehydrogenase，F(xiàn)CSD) FCSD酶在以還原型硫化物為電子供體固定二氧化碳的細菌中廣泛存在。FCSD酶是一個異源二聚體酶，包括1個黃素 (FAD) 亞基和1~2個c-型亞鐵血紅素亞基。但是利用不同載體在大腸桿菌中表達可溶性的光合細菌酒色著色菌Allochromatium vinosum FCSD酶和空泡外硫紅螺菌Ectothiorhodospira vacuolata膜結(jié)合蛋白并未成功，盡管這些載體可以表達FCSDs酶并分泌到細胞周質(zhì)中，但FCSDs酶并不與亞鐵血紅素亞基結(jié)合，從而沒有活性。為了解決這一問題，Smet等[57]建立了一個可以應用于光合宿主的新的表達系統(tǒng)。他們在大腸桿菌中，利用一個寬宿主范圍表達質(zhì)粒pGV910，插入A. vinosum RuBisCo基因的啟動子rbcA，通過結(jié)合方式將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到光合細菌莢膜紅細菌Rba. Capsulatus、球狀紅細菌 Rba. sphaeroides和Ect. vacuolata中，2個Rhodobacter宿主均可以成功地表達有活性的FCSD酶。這表明該表達系統(tǒng)在表達同源重組 c-型的細胞色素中具有很大的應用前景。

3.2.2 細菌啟動子在化合物降解中的應用

啟動子在化合物降解中的應用主要在于調(diào)控載體基因簇上的基因表達。

TOL質(zhì)粒pWW53含有甲苯代謝的相關(guān)基因簇。它含有1個upper代謝基因簇 (包括調(diào)控基因xylR)，可以將甲苯氧化為苯甲酸鈉。除此之外，該質(zhì)粒還含有2個功能同源的meta代謝基因簇 (包括調(diào)控基因 xylS1和 xylS3)，可以代謝芳香羧酸。Gallegos等[53]研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中沒有相關(guān)代謝底物時，upper和meta代謝通路的相關(guān)基因簇均不表達，但xylR基因在 σ70依賴性的啟動子作用下得到表達。xylS1和xylS3基因也在σ70依賴性的啟動子Ps2和Ps3作用下得到表達。當培養(yǎng)基中存在O-二甲苯時，XylR蛋白具有活性并且激發(fā)啟動子Pu，起始upper基因簇的表達。當環(huán)境中含有苯甲酸鈉時，upper代謝通路不起作用，但 2個 meta代謝基因簇均得到表達。當環(huán)境中存在3-甲苯時，2個meta代謝基因簇也會同時表達。以上特性使得該質(zhì)粒在甲苯、苯甲酸以及芳香羧酸化合物降解中具有廣泛的應用性。

質(zhì)粒NAH7含有化合物萘降解的基因簇，該質(zhì)粒是假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的第一個具有代謝作用的質(zhì)粒，可使其相應宿主具有代謝萘和水楊酸鹽的能力。NAH7質(zhì)粒上的基因簇分為2個區(qū)域，第一個區(qū)域為基因簇nahABCDEF，可將化合物萘轉(zhuǎn)化為水楊酸鹽；第二個區(qū)域包括基因簇nahGHIJK，包括水楊酸鹽氧化代謝途徑相關(guān)酶的基因。Yen等[54]將轉(zhuǎn)座子Tn5插入到質(zhì)粒NAH7中，系統(tǒng)研究了Tn5對化合物萘氧化代謝相關(guān)步驟的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tn5可以誘導nahR基因，nahR基因?qū)υ撡|(zhì)?；虼氐?個區(qū)域的基因簇均具有正調(diào)控的功能。對質(zhì)粒 NAH7的研究有利于更好了解萘代謝的機理，從而促進質(zhì)粒NAH7對萘及其相關(guān)化合物降解的研究。

3.2.3 細菌啟動子在物質(zhì)檢測中的應用

由于誘導型啟動子誘導物的專一性較強，使細菌啟動子在物質(zhì)檢測中的應用具有特異性，即一個構(gòu)建好的檢測系統(tǒng)可以專一性地檢測某一化合物或某一類化合物。

Korpela等[52]將生物發(fā)光法用于對四環(huán)素類抗生素的檢測。即將一個信號感應的質(zhì)粒導入到大腸桿菌中，該質(zhì)粒必須是嚴謹調(diào)控型的質(zhì)粒并帶有一個敏感性高的報告基因。Korpela等構(gòu)建了質(zhì)粒pTetLuX1，含有嚴謹調(diào)控型的啟動子 PtetA，在該啟動子的下游插入了 5個熒光素酶基因。利用這一質(zhì)粒構(gòu)造的重組菌可用于四環(huán)素及四環(huán)素類化合物的檢測，而且檢測的精度會隨著pH及Mg2+濃度的變化而變化，實際檢測中可以通過調(diào)節(jié)pH及Mg2+的濃度來調(diào)節(jié)檢測的精度，滿足不同檢測標準的要求。

Anderson等[58]在大腸桿菌中建立了一個人工合成的AND門，基本過程是通過2個啟動子作為“輸入”項，當 2個啟動子均被誘導時，會導致另外一個啟動子被誘導，即產(chǎn)生“輸出”。兩組啟動子之間的聯(lián)系通過mRNA和tRNA的相互作用來實現(xiàn)。第一個啟動子啟動T7 RNA聚合酶基因的表達 (在聚合酶基因后存在2個內(nèi)在的amber終止密碼子)，第二個啟動子啟動amber抑制的tRNA supD基因。當2個基因均表達時，T7 RNA聚合酶才具有活性并啟動 T7啟動子。該方法的輸入與輸出項均是可調(diào)控的，即輸入項的 2個啟動子可以與不同的信號相關(guān)聯(lián)，然后可以輸出不同的細胞信號反應，反應靈敏，而且高效。

3.2.4 細菌啟動子在代謝通路研究中的應用

這是啟動子應用中非常重要的一個方面，啟動子在這方面的應用具有很大優(yōu)勢，因為現(xiàn)有啟動子很多，可提供各種不同誘導強度和不同適用范圍的啟動子；檢測的準確度及效率也很高，一定程度上滿足了代謝通路研究的需要。

生物代謝通路研究中一個很重要的問題是確定代謝通路中的基因是如何行使功能的。Guet等[59]利用組合合成的方法，在大腸桿菌中建立了一個代謝通路連接位點可變的代謝網(wǎng)絡庫。該網(wǎng)絡庫是以啟動子Plac、PtetA、Pλ及其相應的調(diào)控元件LacI，TetR，λCI為基礎(chǔ)建立的。他們模擬二進制的邏輯線路來研究表型的變化，即通過2個化合物的“輸入”，檢測一個熒光蛋白的“輸出”。通過熒光蛋白的檢測表征細胞表型的變化。通過改變模型中代謝網(wǎng)絡的連接點，可以檢測到細胞各種不同的功能變化。組合合成技術(shù)為生物代謝網(wǎng)絡的研究提供了一個很好的方法，該方法不但快捷高效，而且實現(xiàn)了生物有機體活體的實時表型檢測。

盡管很多生物中一個特定基因的敲除或過表達對代謝的影響研究很多，但很少有研究涉及生物中新的代謝通路的添加對生物本身代謝的影響。Isalan等[60]研究了生物中新的代謝通路的添加對生物代謝的影響。他們構(gòu)建了 598個重組的啟動子 (包括調(diào)控區(qū)域)，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建了598個高拷貝的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主對大約95%的新加入的代謝系統(tǒng)具有免疫性，即新的代謝系統(tǒng)可存在于宿主中，但很少有新加入的代謝系統(tǒng)會影響宿主的生長特性。而且他們還發(fā)現(xiàn)，一些加入新的代謝通路的菌株較野生型的菌株在不同的選擇壓力下具有更好的適應性，這表明菌株中新代謝通路的形成對菌株的進化在一定程度上具有促進作用，利于菌株適應環(huán)境的變化。這對于研究細菌的進化也有重要的意義。

以上是誘導型啟動子的研究進展和具體應用。但誘導型啟動子也存在一些缺陷，如有些誘導物價格昂貴；有些光照或溫度誘導的啟動子在實際應用中增加了工業(yè)生產(chǎn)的成本；有些誘導物具有毒性，增加了從產(chǎn)物中去除誘導物的難度，這時組成型啟動子就成了很好的替代工具。

組成型啟動子由于自主啟動表達的特性，不需要外加誘導物或進行額外操作，而且基因的表達大體恒定在同一水平上，不同細胞表達水平?jīng)]有明顯差異。這些特性使該類啟動子在具有經(jīng)濟價值化合物或藥物生產(chǎn)中起著重要的作用。通過改變啟動子?10區(qū)或?35區(qū)的堿基序列或者2個區(qū)域之間的堿基數(shù)，可以獲得一系列不同啟動效率的組成型啟動子[61-62]。但由于一個序列確定的組成型啟動子的啟動效率是一定的，這限制了它的應用，比如其啟動效率無法人為調(diào)控，在一些異源的對宿主有毒害的蛋白表達中就受到限制，因為這類啟動子在宿主生長初期就啟動異源基因的表達，很可能導致菌株死亡；另外，如果啟動子的啟動效率較高，會導致宿主的生長壓力過大，極大影響菌體的生長，這限制了組成型啟動子在生物催化領(lǐng)域的應用。

4 總結(jié)與展望

細菌啟動子在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控上起著重要作用，直接決定蛋白的表達水平，用啟動子構(gòu)建各種表達載體，可以在宿主中方便地表達外源基因；通過啟動子的插入、缺失，或者構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，可以有效改變或調(diào)節(jié)細菌的代謝，方便地獲得目的產(chǎn)物，或者降解不同的化合物，這使得細菌啟動子在全細胞催化和酶催化領(lǐng)域具有巨大的應用價值。隨著基因組測序技術(shù)和生物信息學的飛速發(fā)展，越來越多的細菌基因組被測序，在啟動子已有的研究基礎(chǔ)上，根據(jù)啟動子固有的特征，通過啟動子識別技術(shù)，可以很方便地進行細菌啟動子的識別，使更多不同啟動效率和不同宿主范圍的啟動子被發(fā)現(xiàn)并得到應用，這為全細胞催化和酶催化提供了更多的材料，推動了生物催化技術(shù)的發(fā)展。特別是啟動子改造 (建立在啟動子核心區(qū)域關(guān)鍵位點對啟動子啟動效率研究基礎(chǔ)之上[63]) 和啟動子合成技術(shù)[64]的建立，為獲得研究所需要的啟動子提供了方便，這必將推動啟動子的研究和應用，而啟動子的研究和應用必將為生物催化帶來巨大變革。

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Bacterial promoter recognition and application

Youqiang Xu1, Cuiqing Ma1, Fei Tao2, and Ping Xu2
1 State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China
2 MOE Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Bacterial promoter is a kind of regulators which are needed in bacterial gene expression and decide the strength and opportunity of gene expression. By insertion or deletion of promoters, we can change bacterial gene expression in order to study the growth and metabolic regulation. Promoters are also used to construct many kinds of vectors, so as to express heterologous genes. The study of promoter recognition and application is of great importance to realize the regulation of genes, gain products effectively and promote biological catalysis and metabolic engineering. This paper reviews bacterial promoters, and the methods for recognition of bacterial promoters as well as the study and application of bacterial promoters.

promoter recognition, inducible promoter, promoter application

細菌的基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，而啟動子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中居于關(guān)鍵的地位[1]。隨著生物催化技術(shù)的發(fā)展，細菌啟動子獲得了越來越多的應用。利用啟動子可以改造細菌的代謝通路，或者方便地表達目的蛋白，使其在全細胞催化和酶催化中應用廣泛，在生物催化中占有重要地位。而且該方法與物理法或化學法相比，還具有生產(chǎn)流程簡單、底物的利用效率高、副產(chǎn)物少等特點，降低了產(chǎn)物后處理的成本，在可持續(xù)發(fā)展中具有重要的意義。

May 24, 2010; Accepted: August 11, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30770064), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z401), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803).

Cuiqing Ma. Tel: +86-531-88364003; Fax: +86-531-88369463; E-mail: macq@sdu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 30770064)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2007AA10Z401)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707803) 資助。