徐義剛，李蘇龍，李丹丹，張洪祥，姜艷春

1 黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，哈爾濱 150001

2 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，?？?570125

霍亂弧菌 (Vibrio cholerae，VC) 是引起霍亂的病原菌，在世界上曾引起多次大流行，給人們的生命財產(chǎn)造成巨大的損失[1-2]。自然情況下，人類是VC的唯一易感者，主要通過被病原菌污染的水源或食物經(jīng)口傳染，臨床表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率高[3-4]，屬于國際檢疫傳染病，在我國被列為甲類傳染病?？焖贉蚀_地診斷是及時發(fā)現(xiàn)疫情、迅速采取措施控制疫情的關(guān)鍵[5-7]。

目前，VC的檢測方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定法、血清學方法、PCR方法、膠體金法等。傳統(tǒng)的分離鑒定方法靈敏度和特異性雖然較高，但檢測時間太長，至少需要3~5 d，不適于快速檢測要求[8]；血清學方法主要用于 VC細菌分型，以現(xiàn)有的血清檢測，當新的血清型出現(xiàn)時，易發(fā)生漏檢；PCR法雖然靈敏度高，但受設(shè)備、試劑盒、試劑等條件的限制，基層單位較難開展，不利于霍亂疫情的監(jiān)測[9]；免疫膠體金技術(shù)雖檢測快速，沒有特殊的實驗室條件要求，但該技術(shù)陽性預測值低，最終確診仍以細菌培養(yǎng)為準[10]。因此，發(fā)展操作簡便、快速準確、易推廣的檢測方法對霍亂疫情的監(jiān)測與控制具有重要意義。

DNA環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)是一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的 6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫40~60 min，即可完成核酸擴增反應，直接通過擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷是否發(fā)生反應[11-13]。該項技術(shù)操作簡便，結(jié)果觀察直觀，具有較強的實用價值。本研究選擇VC保守性強的mdh管家基因為靶基因設(shè)計引物，進行VC LAMP快速檢測方法的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的試驗菌株見表 1；Bst DNA Polymerase 購自NEB公司；Taq DNA Polymerase、甜菜堿 (betaine)、SmartGreen購自Sigma 公司；細菌基因組提取試劑盒購自 TaKaRa公司；復合增菌培養(yǎng)基 BPW：蛋白胨 20.0 g、NaCl 10.0 g、Na2HPO4·12H2O 18.0 g、KH2PO43.0 g，蒸餾水定容至1000 mL。

表1 試驗菌株和LAMP特異性結(jié)果Table 1 Bacteria strains used in this study and specificity of LAMP method

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中VC mdh管家基因序列(Accession No. AF343303)，設(shè)計包括兩條外引物Vc：F3和Vc：B3及兩條內(nèi)引物Vc：FIP(F1c+TTTT+F2)和Vc：BIP (B1c+TTTT+B2)等4條LAMP擴增引物，引物序列分別為：Vc:F3：5′-GGATCGTGCGGATCTGTTC -3′(152-170)；Vc:B3：5′-AGGTTTCAGAGCGGAT CAC-3′(348-367)；Vc:FIP：5′-GGCCTTCGGACACACCACAG(214-232)-TTTT-AATGTGAACGCTGG CATTGT(171-190)-3′；Vc:BIP：5′-G-GTCCCTA TCGCAGCCGAAG(268-288)-TTTT-CCAGTGTG GTGACACCAAAT(326-345)-3′，引物由大連TaKaRa公司合成。

1.2.2 細菌基因組DNA的提取

將表1中的細菌株分別接種于5 mL BPW培養(yǎng)基中，根據(jù)每種細菌的最適溫度過夜培養(yǎng)。分別取1 mL培養(yǎng)菌液，使用細菌基因組提取試劑盒(TaKaRa)，提取細菌基因組DNA，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP反應條件

LAMP反應體系為50 μL：10× ThermoPoL Buffer 5 μL (200 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、100 mmol/L (NH4)2SO4、1.0% Tritonx-100)、2.5 mmol/L dNTPs 8 μL、100 mmol/L MgSO42 μL、40 mmol/L Vc:FIP 1 μL、40 mmol/L Vc:BIP 1 μL、10 mmol/L Vc:F3 1 μL、10 mmol/L Vc:B3 1 μL、10 mmol/L 甜菜堿 2 μL、5 U/μL Taq DNA Polymerase 2 μL、8 U/μL Bst DNA Polymerase 2 μL、VC基因組DNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。陰性對照不含VC基因組DNA。將此反應混合物裝在1.5 mL離心管中，置于水浴鍋內(nèi)，水浴溫度分別設(shè)為 60℃、63℃、65℃、67℃，作用一定時間后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，以確定最適反應溫度。LAMP反應溫度確定后，體系反應時間分別設(shè)定為30 min、45 min、60 min、75 min、90 min和120 min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，以確定適宜反應時間。

1.2.4 LAMP擴增副產(chǎn)物觀察

反應結(jié)束后，從水浴鍋中取出反應管，直接通過目視觀察反應管中是否產(chǎn)生LAMP擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，以判斷是否發(fā)生反應，與此同時，利用瓊脂糖凝膠電泳和熒光顯色法驗證。

1.2.5 LAMP靈敏度試驗

將試劑盒提取的VC基因組DNA (細菌濃度相當于2.5×108CFU/mL) 進行10倍梯度稀釋，以此作為模板，進行 LAMP擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，同時進行實時熒光PCR檢測，將兩種方法的靈敏度進行對比。

1.2.6 LAMP特異性試驗

采用本研究建立的LAMP方法擴增經(jīng)試劑盒法提取的表1中33株細菌的基因組DNA，以驗證本方法的特異性。

1.2.7 食品污染模型檢測試驗

取10 g經(jīng)國際標準法檢測未檢出VC的鮮魚肉樣品，加入90 mL堿性蛋白胨水，經(jīng)勻漿機制成勻漿；勻漿中加入1 mL細菌濃度為3.2×108CFU/mL的VC菌株，充分混勻；取1 mL勻漿 (含細菌濃度約為 3.2×106CFU/mL) 進行10倍梯度稀釋；分別取1 mL稀釋后的勻漿液，使用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，進行LAMP擴增。

1.2.8 驗證試驗

將所建立的VC LAMP快速檢測方法應用于檢驗檢疫實踐工作中 (注：疑似人感染霍亂弧菌腹瀉物樣本及未經(jīng)化學和物理方法加工處理的食物樣本可直接進行檢測；對于經(jīng)過加工的食物樣本需經(jīng)初步增菌后，再進行檢測)，其結(jié)果與國際標準 (ISO TS 21872-1-2007) 進行比較，驗證該方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應條件的確立

50 μL的LAMP反應體系分別在60℃、63℃、65℃、67℃水浴中作用相同時間，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，LAMP擴增結(jié)果見圖1A所示，水浴溫度為60℃時，LAMP的擴增效果最弱 (圖1A，泳道 4)，隨著反應體系溫度的升高，擴增效果越加明顯，水浴溫度為 65℃時，擴增效果最佳 (圖1A，泳道2)，即反應體系最適溫度是65℃。LAMP體系最適溫度確定后，水浴作用時間分別設(shè)定為30 min、45 min、60 min、75 min、90 min和120 min，經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結(jié)果見圖 1B所示，水浴時間為30 min時，擴增產(chǎn)物的量最少(圖1B，泳道2)，隨著反應時間的延長，擴增產(chǎn)物的量逐漸增多，從擴增效率和節(jié)省時間的角度考慮，本 LAMP方法的適宜恒溫水浴擴增時間為 60 min (圖1B，泳道4)。

圖1 溫度及反應時間對LAMP擴增效果的影響Fig 1 Effect of temperature and reaction time on the efficiency of LAMP. (A) Effect of temperature on the efficiency of LAMP. 1?4: amplification at 67°C, 65°C, 63°C, 60°C, respectively; 5: DNA marker 100 ladder. (B) Effect of reaction time on the efficiency of LAMP. 1: DNA marker 100 ladder; 2?7: amplification for 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 120 min.

2.2 LAMP擴增副產(chǎn)物檢測結(jié)果

以VC基因組DNA為模板進行LAMP擴增(不含VC基因組DNA的模板為陰性對照)，通過目測觀察，結(jié)果顯示反應管中產(chǎn)生LAMP擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀 (圖 2A)，而陰性對照組未出現(xiàn)，說明LAMP進行有效擴增；利用熒光顯色法檢測結(jié)果顯示，陽性組出現(xiàn)典型的綠色熒光，而陰性對照組為淺橙色熒光 (圖2B)；瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果亦顯示，陽性組發(fā)生LAMP擴增反應，出現(xiàn)典型的LAMP擴增電泳條帶，陰性對照組未發(fā)生反應 (圖2C)。

2.3 LAMP靈敏度試驗結(jié)果

將細菌濃度相當于2.5×108CFU/mL的VC基因組DNA進行10倍梯度稀釋，以每個稀釋度作為模板，進行LAMP擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果見圖3所示，DNA樣本經(jīng)107倍稀釋后，所建立的 LAMP方法仍能進行有效擴增(圖 3，泳道 8)，說明該方法的檢測靈敏度為起始DNA模板濃度的10?7，即相當于25 CFU/mL細菌濃度，與實時熒光PCR方法檢測靈敏度相比，相差一個數(shù)量級 (實時熒光 PCR方法檢測靈敏度為起始DNA模板濃度的10?8，結(jié)果未顯示)，但從實驗易操作性、低成本角度出發(fā)，本方法不失為一種理想的選擇。

2.4 LAMP特異性試驗結(jié)果

使用建立的VC LAMP檢測方法對33株細菌進行檢測，結(jié)果見表 1所示，僅 VC O1群 (ATCC 14035)、VC O139群 (CMCC 16010)、VC非O1/非O139群 (ATCC 51394) 呈陽性反應，其他細菌的LAMP擴增呈陰性，說明該方法能特異性地檢測VC。

圖2 VC基因組DNA LAMP擴增副產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig. 2 Detection results of LAMP amplification outgrowth of genomic DNA of Vibrio cholerae. (A) Observation of turbidity. 1: precipitation produced by LAMP amplification of mdh gene of Vibrio cholerae, as arrow showing; 2: negative control. (B) Observation of fluorescence. 1: negative control; 2: result of LAMP amplification of mdh gene of Vibrio cholerae shows green fluorescence. (C) Detection of electrophoresis. 1: DNA marker; 2: result of LAMP amplification mdh gene of Vibrio cholerae; 3: negative control.

2.5 污染食品檢測靈敏度

對細菌起始濃度約為3.2×106CFU/mL的模擬污染食品進行LAMP檢測，檢測結(jié)果見圖4所示，該LAMP方法對污染食品中VC的檢測靈敏度為32 CFU/mL。

2.6 實踐驗證結(jié)果

2009年1~9月期間，使用所建立的VC LAMP方法對1057份蝦、蟹、牡蠣、肉類食品樣品和來自黑龍江省疾病控制中心的人腹瀉物樣品進行檢測，同時采用國際標準方法進行驗證，結(jié)果見表 2所示，用LAMP方法檢出的85份陽性樣本，經(jīng)國際標準方法驗證，結(jié)果為陽性。顯示該LAMP方法具有廣泛而良好的適用性。

圖3 VC基因組DNA LAMP檢測靈敏度Fig. 3 Sensitivity of LAMP for genomic DNA of Vibrio cholerae. 1: DNA marker; 2: 10?1; 3: 10?2; 4: 10?3; 5: 10?4; 6: 10?5; 7: 10?6; 8: 10?7; 9: 10?8; 10: negative control.

圖4 污染食品中VC的LAMP檢測靈敏度Fig. 4 Sensitivity of LAMP for detecting Vibrio cholerae in food. 1: DNA marker; 2: 10?2; 3: 10?3; 4: 10?4; 5: 10?5; 6: 10?6; 7: food control.

表2 LAMP方法與國際標準 (ISO) 對比結(jié)果Table 2 Comparison between LAMP and ISO method in practice

3 討論

霍亂是由VC引起的一種烈性腸道傳染病，在一定條件下，VC進入小腸，粘附于腸壁上皮細胞，在腸粘膜表面迅速繁殖，產(chǎn)生霍亂腸毒素，進而急驟發(fā)病[14]。目前，霍亂疫情在國內(nèi)外仍有不斷發(fā)生和流行，由于霍亂流行迅速，且在流行期間發(fā)病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預防本病的蔓延有重大意義。

目前，VC的檢測方法仍以分離培養(yǎng)、形態(tài)學、生化特征及血清學鑒定為主，耗時長，不利于疫情監(jiān)控。后來發(fā)展的探針雜交法[15]和PCR方法[16]雖具有較好的特異性和靈敏度，但由于試劑及實驗設(shè)備等條件的限制，難于在基層廣泛推廣應用。因此開發(fā)一種特異性高、靈敏度好、檢測快速、操作簡便，并且成本低廉，適于基層推廣的檢測方法，對霍亂疫情的監(jiān)控將起到積極作用。Notomi等[11]于2000年研發(fā)出一種新穎的核酸擴增方法-環(huán)介導等溫擴增法 (LAMP)，其特點是針對靶序列的6個特異性區(qū)域設(shè)計兩對引物 (確保了反應的高特異性)，利用具有鏈置換活性的Bst DNA polymerase，恒溫條件進行核酸擴增，在擴增過程中，產(chǎn)生的焦磷酸鹽和鎂離子結(jié)合，生成大量的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂 (白色沉淀)，通過觀測是否形成白色沉淀，判斷擴增反應是否發(fā)生。該方法特異性強、靈敏度高、操作簡便、設(shè)備要求極低，自從報道以來，在核酸研究、疾病診斷、性別鑒定、轉(zhuǎn)基因檢測及病原檢測等領(lǐng)域得到廣泛應用。

本實驗利用DNA環(huán)介導等溫擴增技術(shù)進行VC LAMP快速檢測方法的研究。首先是檢測靶基因的選擇，已有的 VC分子生物學檢測方法均選擇 VC的毒力基因ctxAB (編碼霍亂腸毒素) 與tcpA (編碼毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A亞單位) 為目標基因[15-16]，但由于部分O1群VC缺失這些毒力基因，而存在局限性。VC mdh管家基因在不同群型中具有高度保守性[17]，是作為檢測靶基因的理想選擇。因此，本研究以VC mdh管家基因為靶基因開展研究，經(jīng)過引物的精確設(shè)計及反應體系的條件優(yōu)化，建立了VC LAMP快速檢測方法。該方法最佳反應溫度為65℃，60 min內(nèi)即可完成檢測，結(jié)果判定直觀，也可借助電泳檢測儀進行結(jié)果的判定。該方法具有較高的檢測靈敏度 (純培養(yǎng)菌的檢測限為25 CFU/mL，污染食品中VC的檢測限為32 CFU/g) 和特異性 (詳見表1)。該方法與實時熒光PCR法相比，其靈敏度雖相差一個數(shù)量級，但LAMP方法不需要使用PCR儀等昂貴、精密的儀器設(shè)備，操作更簡便、檢測成本更低，尤其適用于基層檢驗檢疫機構(gòu)，為 VC的疫情監(jiān)控和快速檢測提供了新的發(fā)展方向。

此外，為了進一步降低檢測成本，病原菌基因組DNA提取可采用煮沸法，亦可達到理想的檢測效果。具體方法如下：取細菌培養(yǎng)液1 mL，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μL無菌水，充分懸浮混勻，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12 000 r/min離心5 min，上清液保存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

REFERENCES

[1] Colwell RR. Global climate and infectious diseases: the cholera paradigm. Science, 1996, 274: 2025?2031.

[2] Thompson FL, Iida T, Swings J. Biodiversity of Vibrio. Microbiol and Mol Bio Rev, 2004, 68(3): 403?431.

[3] Bhattacharya SK, Bhattacharya MK, Nair GB, et al. Clinical profile of acute diarrhoeal cases infected with the new epidemic strain of V. cholerae O139: designation of the disease as cholera. J Infect, 1993, 27:11?15.

[4] Colwell RR, Spira WM. The ecology of Vibrio cholerae//Barua D, Greenough WB III, ed. Cholera. New York: Plenum, 1992: 107?127.

[5] Barua D, Merson MH. Prevention and control of cholera//Barua D, Greenough WB III, eds. Cholera. New York: Plenum, 1992: 329?349.

[6] Albert MJ, Islam D, Nahar S, et al. Rapid detection of Vibrio cholerae O139 Bengal from stool specimens by PCR. J Clin Microbiol, 1997, 35: 1663?1665.

[7] Colwell RR, Hasan JAK, Huq A, et al. Development and evaluation of rapid, simple, sensitive, monoclonal antibody-based co-agglutination test for direct detection of Vibrio cholerae O1. FEMS Microbiol Lett, 1992, 76: 215?219.

[8] Hong HY, Xu GQ. Exploration of rapid detection for Vibrio cholerae. Chin J Henan Univ, 2004, 23(4): 22.黃紅瑩, 許國強. 霍亂弧菌快速檢測法探討. 河南大學學報, 2004, 23(4): 22.

[9] Albert MJ, Islam D, Nahar S, et al. Rapid detection of Vibrio cholerae O139 Bengal from stool specimens by PCR. J Clin Microbiol, 1997, 35(6): 1633?1635.

[10] Dong ZH, Hu SX, Zeng YX, et al. Evaluation of clinical effect for rapid detection test-paper of Vibrio cholerae O139. Appl Prev Med, 2004, 11(5): 973?974.鄧志紅, 胡世雄, 曾亞雄, 等. O139霍亂弧菌快速檢測試紙條臨床效果評價. 實用預防醫(yī)學, 2004, 11(5): 973?974.

[11] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loopmediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 2000, 28(12): E63?e63.

[12] Mori Y, Nagamine K, Tmita N, et al. Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 289: 150?154.

[13] Nagamine K, Watanage K, Ohtsuka K, et al. Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clin Chem, 2001, 47: 1742?1743.

[14] Merrell DS, Butler SM, Qadri F, et al. Host-induced epidemic spread of the cholera bacterium. Nature, 2002; 417(6889): 642?645.

[15] Nair GB, Bag PK, Shimada T, et al. Evaluation of DNA probes for specific detection of Vibrio cholerae O139 Bengal. J Clin Microbiol, 1995, 33(8): 2186?2187.

[16] Glukhov AI, Onishchenkpo GG, Gordee VSA, et al. The determination of the content of the cholera toxin gene in the composition of the DNA from Vibrio cholerae strains by means of the nested polymerase chain reaction. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 1996, 5: 20?22.

[17] Rui YY, Kan B, Gao SY, et al. Sequence analysis of housekeeping genes recA, dnaE, and mdh in different serogroups or biotypes of Vibrio cholerae isolated from China. J South Med Univ, 2006, 26(12): 1720?1723.芮勇宇, 闞飆, 高守一, 等. 不同群型霍亂弧菌 recA、dnaE和 mdh管家基因序列分析. 南方醫(yī)科大學學報, 2006, 26(12): 1720?1723.