張淑金，孟書燕，雷蕾，程祥，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100

體細(xì)胞隨著分裂次數(shù)的增加端粒不斷縮短，從而影響基因組的穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞的衰老和死亡。端粒酶 (TERT) 能以其自身 RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成端粒的重復(fù)序列，延長端粒 (Telomere) 的長度，提高基因組的穩(wěn)定性，保證細(xì)胞的持續(xù)增殖能力[1-3]。除一些特別組織 (如睪丸等) 外，成體細(xì)胞中TERT的表達(dá)水平較低，而在胚胎干細(xì)胞中 TERT能始終保持很高的活性。因此，端粒酶的高表達(dá)對于維持干細(xì)胞自我更新能力和多分化潛能具有重要意義[4]。

2006年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc (OSKM) 4個轉(zhuǎn)錄因子，可以將鼠的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells，iPS)[5]，其細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特點(diǎn)與ES細(xì)胞相似。在小鼠iPS細(xì)胞建系成功后，又有4個科研小組先后報(bào)道了人iPS細(xì)胞建系[6-9]。最近，猴[10]、大鼠[11-12]和豬[5]的iPS細(xì)胞系也已成功建立。iPS細(xì)胞的產(chǎn)生為干細(xì)胞研究開辟了一條新途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景。由于 iPS細(xì)胞研究剛剛起步，還有許多問題和影響因素有待解決。其中 iPS細(xì)胞重編程過程中TERT的活性變化，是值得研究的一個問題。

盡管體細(xì)胞重編程在小鼠和人上已經(jīng)有較深入地研究，但在家畜特別是山羊上的研究還在探索中。另外，山羊體內(nèi)各種組織細(xì)胞中的 TERT表達(dá)變化目前也不清楚。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time RT-PCR)[15]對關(guān)中奶山羊胎兒組織和重編程細(xì)胞中端粒酶基因相對表達(dá)量進(jìn)行了檢測，探討iPS細(xì)胞形成與端粒酶基因表達(dá)之間的對應(yīng)關(guān)系，以及堿性磷酸酶陽性和陰性的重編程細(xì)胞端粒酶基因表達(dá)水平的差異，以期為山羊 iPS細(xì)胞的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖DMEM、谷氨酰胺、胎牛血清 (FBS)、β-巰基乙醇、非必須氨基酸均購自Gibco，人bFGF購自Millipore，α-奈酚磷酸鹽、堅(jiān)固紅TR鹽、絲裂霉素 C均購自 Sigma，RNA提取試劑 Trizol購自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas。TRET一抗購自Abcam，綠色熒光二抗購自鼎國生物制品有限公司。

MEF培養(yǎng)液為：高糖DMEM+10%新生牛血清(NBS)+100 IU/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素。

山羊重編程細(xì)胞培養(yǎng)液為：高糖 DMEM+15% FBS+2 mmol/L谷氨酰胺+0.1 mmol/L非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+4 ng/mL bFGF+100 IU/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素。

根據(jù)山羊Tert mRNA序列 (GenBank Accession No. EU139124.1) 和山羊 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) mRNA 序列 (GenBank Accession No. AF030943)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成熒光定量PCR引物 (表1)。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列表Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2 方法

1.2.1 關(guān)中奶山羊胎兒組織RNA的提取

取胎膜完整的3月齡關(guān)中奶山羊胎兒，浸泡在含有雙抗的生理鹽水中，4℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水沖洗山羊胎兒，取胎兒皮膚、睪丸、腦、肌肉、腎、肝、脾、肺等組織，切成1 mm3左右的小塊，立即放入裝有適量液氮的研缽中迅速研磨成粉末，研磨過程中始終保持研缽內(nèi)有液氮。然后將組織粉末移入1.5 mL的EP管中，加入1 mL Trizol裂解組織，劇烈振蕩30 s，并在室溫放置5 min。加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。樣品分為3層：上層無色水相，下層粉紅色有機(jī)相，中間蛋白質(zhì)膜層。將上清轉(zhuǎn)移至另一新的DEPC處理過的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫放置30 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀。4℃、7 500 r/min離心5 min，室溫放置10~15 min干燥，加入60 μL DEPC水溶解RNA沉淀，?80℃保存。Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度儀檢測 RNA的質(zhì)量和濃度。所得RNA 260 nm/280 nm介于1.8~2.0之間，符合純度要求。取 3 μg總 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 操作說明書進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA置于?20℃保存。

1.2.2 SYBR Green 實(shí)時(shí)定量PCR

首先對樣品進(jìn)行標(biāo)定。取待測樣品的cDNA分別稀釋1、10、100和1 000倍。取不同濃度稀釋的樣本cDNA 2 μL，分別加入2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DMSO 1.25 μL，去離子水7.25 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。將不同反應(yīng)體系置于 96孔 Clear Optical Reaction Plate內(nèi)，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 (LineGene9600)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行熒光定量，檢測目的基因和內(nèi)參基因 (GAPDH) 在不同濃度稀釋樣本中的擴(kuò)增情況。反應(yīng)條件為: 94 ℃ 2 min ，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。從72℃到94℃每上升0.5℃取1次熒光值。試驗(yàn)證明10倍稀釋樣品的Ct值在15~30個循環(huán)出現(xiàn)。取10倍稀釋濃度的樣本cDNA 2 μL，加入2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上、下游引物各1 μL (10 μmol/ L)，DMSO 1.25 μL，去離子水7.25 μL，總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，從72℃到94℃ 每上升0.5℃取1次熒光值。最后生成溶解曲線，通過溶解曲線確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。對細(xì)胞進(jìn)行檢測時(shí)，細(xì)胞RNA樣品的制備提取詳見1.2.1。山羊胎兒成纖維細(xì)胞 (GEF) 為對照；AP+為堿性磷酸酶 (AP) 陽性的原代重編程細(xì)胞；14#、25#為傳到第4代的重編程細(xì)胞；F11#、F12#為傳到第16代的重編程細(xì)胞。上述4株細(xì)胞均為AP陰性。Real-time RT-PCR反應(yīng)程序和定量分析，同上。每個組織或細(xì)胞株取 3組樣品進(jìn)行測定，每組樣品設(shè)3個重復(fù)，用隨機(jī)攜帶的圖像定量分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.3 關(guān)中奶山羊皮膚成纖維細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)

無菌條件下取皮膚1 mm3左右，置于含有雙抗的PBS中，反復(fù)漂洗直到漂洗液清亮透明為止，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中剪棄脂肪和結(jié)締組織，用鑷子將組織塊在培養(yǎng)皿上均勻擺置，每小塊間距5 mm左右，組織塊放置好后，向皿內(nèi)組織塊上滴加少量培養(yǎng)液，放入37℃培養(yǎng)箱中。第2天向皿內(nèi)再加入少許培養(yǎng)液，以后每3天換1次培養(yǎng)液，每天在倒置相差顯微鏡下觀察，有成纖維細(xì)胞游離出后，長到細(xì)胞成片時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞生長曲線測定時(shí)，將胎兒成纖維細(xì)胞分別以3×104細(xì)胞數(shù)/孔接種于已鋪被0.1%明膠的24孔板內(nèi)，加入培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)。每 2天換液1次。每24 h分別消化3孔細(xì)胞，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞總數(shù)，求平均值。細(xì)胞接種當(dāng)天記為第 0天，連續(xù)測定 8 d。以培養(yǎng)時(shí)間 (d) 為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)(1×104/mL) 為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。公式為TD=t×log2/(logNt?logN0)，式中TD為細(xì)胞群體倍增時(shí)間，t為培養(yǎng)時(shí)間，N0為接種后的細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)[16]。

胎兒成纖維細(xì)胞核型分析時(shí)，將處于對數(shù)生長期 (第3天) 的GEF細(xì)胞，用濃度為0.2 μg/mL秋水仙素處理1.5 h，PBS洗2遍，0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞，棄上清，加入預(yù)溫37℃、0.075 mol/L的KCL低滲液5 mL，37℃水浴作用低滲15~25 min。1 000 r/min離心收集細(xì)胞，加入固定液(甲醇與冰醋酸3∶1) 5 mL，室溫下作用2 h，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，2次固定室溫作用30 min。1 000 r/min離心收集細(xì)胞，加入0.1 mL固定液，輕輕吹打混勻制成懸液。距離載玻片約l m高度，向經(jīng)過?20℃預(yù)冷的玻片滴 2滴細(xì)胞懸液，空氣中自然干燥。用吉姆薩染色10~20 min后用自來水沖洗。干燥后，在倒置顯微鏡下觀察染色體核型情況。

1.2.4 誘導(dǎo)山羊細(xì)胞重編程

取生長旺盛的包裝病毒 Phoenix-A細(xì)胞按照8×105/mL接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)，24 h后，將鼠的 4個轉(zhuǎn)錄因子 pMXs-Oct4、 pMXs-Sox2、pMXs-Klf4和pMXs-c-Myc轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞，6 h后換成含血清體積分?jǐn)?shù)為 10%的培養(yǎng)液，收48 h病毒液，0.45 μm濾膜過濾。將4種病毒液按照1∶1∶1∶1的比例混合，按照4 μg/mL的比例加入polybrene，混合均勻，加到提前1 d按8×104/mL鋪好的GEF第1代的細(xì)胞中，可進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染以提高轉(zhuǎn)染效率。為了保證轉(zhuǎn)染效率，病毒的滴度要求達(dá)到 1×106~5×106以上，病毒轉(zhuǎn)染的當(dāng)天為誘導(dǎo)0 d。按照上述方法再攻毒1次。以后每天換 1次培養(yǎng)液，第3天將攻過毒的 GEF細(xì)胞按照5×103/mL的比例鋪到MEF飼養(yǎng)層上。24 h后換成iPS細(xì)胞培養(yǎng)液，以后每天換液1次，誘導(dǎo)12 d左右開始出現(xiàn)細(xì)胞克隆，18 d左右用機(jī)械法在體視顯微鏡下挑取克隆，接種到已經(jīng)鋪好MEF飼養(yǎng)層的96孔板上，選20株形態(tài)好的克隆編號、擴(kuò)增、凍存。

對部分克隆細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色。用40 g/L多聚甲醛溶液室溫固定集落10 min，無鈣鎂PBS沖洗3次，每次間隔10 min。再加入AP染液(0.2 mg/mL α奈酚磷酸鹽，1 mg/mL堅(jiān)固紅TR鹽，0.1 mol/L Tris-HCl，調(diào)節(jié) pH值為 8.6)，作用10~20 min。吸出染色液，用PBS沖洗后，倒置顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞為紅色，陰性細(xì)胞不著色。

1.2.5 對誘導(dǎo)的重編程細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測

待細(xì)胞長到 70%~80%時(shí)，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS洗滌3次，每次3~5 min，0.5% Triton打孔15 min；PBS漂洗2次，每次5 min；加入1% BSA封閉30 min；棄去，此步驟不用洗滌，直接加入1% BSA稀釋的一抗Tert，4℃過夜；PBS漂洗3次，每次5 min；加入1% BSA稀釋的綠色的熒光二抗，于37℃孵育0.5~1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；Leica倒置熒光顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果

2.1 山羊組織中TERT的表達(dá)檢測

采用Real-time RT-PCR方法，對關(guān)中奶山羊不同組織中端粒酶基因表達(dá)量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明相對表達(dá)量最高的是睪丸組織。內(nèi)胚層的3種組織中肝、脾的 TERT表達(dá)量較高，是皮膚組織的 6~7倍，而肺臟的TERT量比其他兩種組織要低1倍以上。中胚層的肌肉和腎臟組織中TERT的表達(dá)量是皮膚組織的3~5倍。TERT表達(dá)量最低的是外胚層的大腦和皮膚組織，端粒酶相對表達(dá)量在 1左右(圖1)。

圖1 Real-time RT-PCR定量分析山羊組織中TERT表達(dá)量Fig. 1 Real-Time RT-PCR analysis of TERT expression in goat tissues. The RNA samples were made from Guanzhong milk goat tissues including skin, testis, brain, muscle, kidney, liver, spleen, and lung. The relative expression level was calculated by goat TERT (gTERT) vs internal control GAPDH (n=3).

2.2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與檢測

為了進(jìn)行體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程研究，我們首先制備了山羊胎兒成纖維細(xì)胞。將山羊皮膚組織塊接種后，第 2天可以看到原代胎兒成纖維細(xì)胞從組織塊周圍遷出，逐漸向四周擴(kuò)散。在倒置顯微鏡下觀察組織塊透光性較差，呈現(xiàn)為暗黑色遮光區(qū)域 (圖2A箭頭處)。遷出的細(xì)胞界限較清楚，細(xì)胞以成纖維樣為主，也可見不規(guī)則三角形樣，細(xì)胞核呈類圓形或長橢圓形，細(xì)胞排列緊密 (圖2A)。以后每隔2天換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞1周即可長滿皿底。

對山羊 GEF細(xì)胞生長曲線作了測定，細(xì)胞在1~2天的潛伏適應(yīng)期后，第3天進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天進(jìn)入生長平臺期，第8天后便進(jìn)入衰退期。分離得到的細(xì)胞樣品不同代次的倍增時(shí)間分別為P1代36.2 h，P4代39.8 h (圖2B)。這一結(jié)果表明原代細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加，其生長活力逐步下降。核型分析表明，GEF染色體核型60條，為雄性xy，可用于細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) (圖2C、D)。

2.3 誘導(dǎo)山羊體細(xì)胞重編程

誘導(dǎo)山羊體細(xì)胞重編程是個緩慢的過程，一般需要 15~20 d以上的培養(yǎng)時(shí)間。在攻毒時(shí)，取 1~3代生長狀態(tài)好、細(xì)胞活力強(qiáng)、密度適中的GEF作為受體細(xì)胞 (圖3A)。為加強(qiáng)誘導(dǎo)效率，可對細(xì)胞進(jìn)行二次攻毒。攻毒后3 d，將細(xì)胞接到有MEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿上，細(xì)胞密度在5×103/mL左右 (圖3B)。誘導(dǎo)的細(xì)胞在10~12 d開始出現(xiàn)克隆集落，周圍的細(xì)胞逐漸開始聚團(tuán)，從成纖維細(xì)胞時(shí)的長梭樣形態(tài)變?yōu)閳A形并聚集成集落。初始的克隆集落較小，出現(xiàn)兩種形態(tài)，扁平狀集落和隆起狀集落 (圖3C)。隆起的克隆逐漸變黑，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸不清晰，挑單克隆之后不再繼續(xù)生長，逐漸死亡。扁平的集落邊緣整齊，核質(zhì)比高，挑單克隆之后可以繼續(xù)傳代培養(yǎng)，且保持基本的細(xì)胞形態(tài)。持續(xù)培養(yǎng)15 d后，克隆集落長大，成圓形或者橢圓形，邊緣整齊，核質(zhì)比較高，挑克隆，進(jìn)行傳代培養(yǎng) (圖3D)。

圖2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞 (GEF) 的培養(yǎng)與鑒定Fig. 2 Culture and characterization of GEF cells. (A) Primary tissue culture of GEF. Arrow indicates the tissue block. (B) The growth curve of GEF at first and fourth passages. (C) The karyotype of GEF. (D) The paired chromosomes of GEF.

圖3 山羊GEF細(xì)胞誘導(dǎo)為重編程細(xì)胞Fig. 3 The experimental outline to induce goat GEFs into the reprogrammed cells. (A) Uninfected GEFs (50×). (B) GEFs infected by retrovirus with OSKM (50×). (C) The reprogrammed cell colonies formed in 12 days after the infection (50×). (D) A goat reprogramming cell colony (50×).

2.4 測定山羊重編程細(xì)胞中TERT的表達(dá)變化

將 4種轉(zhuǎn)錄因子 OSKM導(dǎo)入 GEF細(xì)胞 (圖4A1)，經(jīng)過15~20 d誘導(dǎo)，培養(yǎng)皿上出現(xiàn)大量克隆集落，經(jīng)堿性磷酸酶 (AP) 染色，可見 AP陽性克隆 (圖4A2)。對典型的重編程克隆進(jìn)行挑選和編號，并選出4株克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增培養(yǎng)，制備RNA樣品(圖4A3?6)。對上述樣品，用Real-time RT-PCR方法定量分析TERT基因的表達(dá)變化。檢測結(jié)果表明，在誘導(dǎo)出的原代AP陽性重編程細(xì)胞 (AP+) 中端粒酶的相對表達(dá)量最高，是誘導(dǎo)前GEF細(xì)胞的65倍(圖4B)。而分離傳代的4株AP陰性重編程細(xì)胞，其端粒酶相對表達(dá)量明顯比對照組GEF細(xì)胞高，但是卻顯著低于原代 AP陽性重編程細(xì)胞 (AP+)。以上結(jié)果說明端粒酶基因表達(dá)量高低與誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的完全程度成正相關(guān)，AP陽性重編程細(xì)胞端粒酶的表達(dá)量較高，而 AP陰性重編程細(xì)胞端粒酶的表達(dá)量相對較低。

圖4 山羊重編程細(xì)胞克隆和TERT定量檢測Fig. 4 The quantitative analysis of TERT expression level in goat reprogramming cells. (A) Goat reprogramming cell clones. 1: Uninduced GEF cells (GEF); 2: AP+ Clone No. 1; 3: APClone No.14; 4: AP- Clone No. 25; 5: AP- Clone F11; 6: APClone F12. The magnification of images is 50×. (B) Real-Time RT-PCR analysis of TERT expression among the different reprogramming cell clones as described in (A). The relative expression level was calculated by goat TERT (gTERT) vs internal control GAPDH (n=3).

2.5 端粒酶免疫熒光檢測

對誘導(dǎo)出的重編程克隆進(jìn)行擴(kuò)增、凍存。端粒酶免疫熒光檢測，堿性磷酸酶 (AP) 陽性的克隆進(jìn)行端粒酶免疫熒光檢測時(shí)呈陽性 (圖 5A、B)，AP陰性的克隆端粒酶免疫熒光檢測呈陰性 (圖5C、D)。

圖5 免疫熒光檢測山羊重編程細(xì)胞中端粒酶的表達(dá)Fig. 5 TERT immunofluorescence analysis of the reprogrammed cells. (A, B) The reprogrammed AP+ cell clone. (C, D) The reprogrammed AP- cell clone. (A, C) The phase contract. (B, D) TERT immunofluorescence staining.

3 討論

在Real-time RT-測定中采用相對定量法通常是以表達(dá)恒定的看家基因作為內(nèi)參照，在目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同的情況下，可以直接得到目的基因相對于內(nèi)參基因的定量[17]。本實(shí)驗(yàn)中端粒酶基因表達(dá)量是以看家基因GAPDH作為參照測定出來的。我們首次對山羊胎兒組織中 TERT基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明睪丸組織中 TERT的表達(dá)量顯著高于其他組織。另外，我們還注意到不同胚層來源的組織其 TERT的表達(dá)量也存在差異，其表現(xiàn)為 TERT表達(dá)量在內(nèi)胚層組織＞中胚層組織＞外胚層組織。Greenberg 等報(bào)道TERT基因在成年鼠的各種組織中有廣泛的低水平表達(dá)，而在胎鼠中胸腺和腸道組織 TERT的表達(dá)水平比其他組織的表達(dá)顯著要高[18-19]。但是，由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的問題，我們未能對山羊胎兒胸腺組織中 TERT的表達(dá)作出檢測。這一缺陷需要在今后的研究中解決。

2006年，日本科學(xué)家報(bào)道了利用4種轉(zhuǎn)錄因子(OSKM) 將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)[5]。在此之后，在人[7]、猴[11]、大鼠[13]、豬[14]等動物也得到了 iPS細(xì)胞，說明 iPS技術(shù)可以廣泛用于建立動物 iPS細(xì)胞系，從而彌補(bǔ)缺少大動物ES細(xì)胞的缺口。目前，還未見在山羊中得到iPS細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。本研究初步探討了誘導(dǎo)山羊重編程細(xì)胞的誘導(dǎo)方法和培養(yǎng)體系，得到了 AP陽性的山羊重編程細(xì)胞。但是我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，部分重編程細(xì)胞的比率很高，極大阻礙了山羊 iPS細(xì)胞建系，因此影響細(xì)胞重編程的因素還需要進(jìn)一步探索。

GEF細(xì)胞在導(dǎo)入了外源基因后會明顯加快增殖速度，4 d之后會發(fā)生明顯的形態(tài)改變。在誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞往往會在ES樣克隆出現(xiàn)之前便已長滿整個培養(yǎng)皿，這時(shí)需要對其進(jìn)行傳代，盡管有報(bào)道稱誘導(dǎo)過程中傳代會影響誘導(dǎo)的效率，但是不及時(shí)傳代將會導(dǎo)致受體細(xì)胞大量死亡。在連續(xù)傳代過程中，應(yīng)盡量采用Ⅳ型膠原酶進(jìn)行細(xì)胞消化，這樣可以除去傳代過程中飼養(yǎng)層的干擾。

外源基因?qū)κ荏w細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程不局限于同一物種，異源轉(zhuǎn)錄因子同樣可以誘導(dǎo)受體細(xì)胞成為iPS細(xì)胞[20]。原因可能由于多能性轉(zhuǎn)錄因子在不同物種之間具有很高的保守性，可以調(diào)控異種受體細(xì)胞基因的表達(dá)，從而啟動重編程過程。所以試驗(yàn)中用鼠的4個轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)關(guān)中奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞同樣得到了重編程細(xì)胞。

在對端粒酶表達(dá)活性進(jìn)行檢測的過程中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過OSKM誘導(dǎo)后的重編程細(xì)胞中的TERT表達(dá)明顯高于受體成纖維細(xì)胞，TERT表達(dá)量的高低與誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的程度有直接關(guān)聯(lián)。AP陽性的重編程細(xì)胞 TERT表達(dá)量要高于處于部分重編程的細(xì)胞(AP陰性)。我們還發(fā)現(xiàn)分離得到的重編程細(xì)胞克隆隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增高，端粒酶的表達(dá)活性逐漸減弱。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能與內(nèi)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子尚未完全活化，而外源導(dǎo)入的4個因子又隨傳代逐漸沉默有關(guān)。進(jìn)一步揭示TERT的活化與iPS細(xì)胞的重編程關(guān)系，將有益于提高山羊 iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率和成功建系。

REFERENCES

[1] Horikawa I, Chiang YJ, Patterson T, et al. Differential cis-regulation of human versus mouse TERT gene expression in vivo: identification of a human-specific repressive element. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(51): 18437?18442.

[2] Takakura M, Kyo S, Inoue M, et al. Function of AP-1 in transcription of the telomerase reverse transcriptase gene (TERT) in human and mouse cells. Mol Cell Biol, 2005, 25(18): 8037?8043.

[3] Achi MV, Ravindranath N, Dym M. Telomere length in male germ cells is inversely correlated with telomerase activity. Biol Reprod, 2000, 63(2): 591?598.

[4] Golubev AG. Biochemistry of space and time (telomeres, telomerases, and longevity of cell populations and multicellular organisms). Biokhimiia, 1996, 61(11): 2045?2059.

[5] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4): 663?676.

[6] Maherali N, Sridharan R, Xie W, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell, 2007, 1(1): 55?70.

[7] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, 131(5): 861?872.

[8] Yu JY, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007, 318(5858): 1917?1920.

[9] Park IH, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature, 2008, 451(7175): 141?146.

[10] Lowry WE, Richter L, Yachechko R, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(8): 2883?2888.

[11] Liu HS, Zhu FF, Yong J, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell, 2008, 3(6): 587?590.

[12] Li WL, Wei W, Zhu SY, et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell, 2009, 4(1): 16?19.

[13] Liao J, Cui C, Chen SY, et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell, 2009, 4(1): 11?15.

[14] Esteban MA, Xu JY, Yang JY, et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J Biol Chem, 2009, 284(26): 17634?17640.

[15] Gomes AL, Melo FL, Werkhauser RP, et al. Development of a real time polymerase chain reaction for quantitation of Schistosoma mansoni DNA. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2006, 101(Suppl 1): 133?136.

[16] Wang H, Dou ZY, Wang HY. Growth and identification of human amniotic fluid stem cells and analysis of their influencing factors. J Agr Biotechnol, 2008, 16(5): 804?809.王晗, 竇忠英, 王華巖. 人源羊水干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及影響因素分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2008, 16(5): 804?809.

[17] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT. Methods, 2001, 25(4): 402?408.

[18] Greenberg RA, Allsopp RC, Chin L, et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene, 1998, 16(13): 1723?1730.

[19] Horikawa I, Chiang YJ, Patterson T, et al. Differential cis-regulation of human versus mouse TERT gene expression in vivo: identification of a human-specific repressive element. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(51): 18437?18442.

[20] Wu Z, Chen JJ, Ren JT, et al. Generation of pig induced pluripotent stem cells with a drug-inducible system. J Mol Cell Biol, 2009, 1(1): 46?54.