朱甫祥，宮賢弟，劉澤隆，楊樹德，屈慧鴿，遲曉艷

1 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264025

2 Department of Physiology & Biophysics, Medical college of Dalhousie University, Halifax B3H 4H7, Canada

CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 為cAMP依賴性氯離子 (Cl?) 通道蛋白，由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 (Transmembrane domains，TMDs)、2個(gè)核苷酸結(jié)合域 (Nucleotidebinding domains，NBDs) 和1個(gè)調(diào)節(jié)域 (Regulatory domain，RD)。囊性纖維化 (Cystic fibrosis，CF) 是由該基因突變引起的一種常染色體隱性遺傳疾病[1]。屬于單基因突變的該病是體細(xì)胞基因治療的適應(yīng)癥。因此自1989年CFTR基因的成功克隆，對(duì)CF的基因治療研究成為熱點(diǎn)。基因治療中合適的基因運(yùn)載體系是關(guān)鍵，在眾多已開發(fā)的載體系統(tǒng)中，腺輔助病毒 (Adeno-associated viruses，AAV) 由于非致病性、可感染非增殖期細(xì)胞、定點(diǎn)整合宿主基因組使轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá)且安全性高以及不會(huì)引起宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，為基因治療的理想載體，而且AAV5具有靶向感染呼吸道上皮細(xì)胞的特性[2]，使其特別適合CFTR基因的呼吸道上皮細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移。CFTR的編碼序列長(zhǎng)4.4 kb，加上基因調(diào)控序列，難以為包裝容量上限為4.7 kb的AAV所承載。Intein的蛋白質(zhì)反式剪接作用為雙AAV載體轉(zhuǎn)運(yùn)CFTR基因提供了一種分子手段。Intein為包埋于原核生物和單細(xì)胞真核生物某些蛋白前體中的一段多肽序列，翻譯后通過蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)被切除，同時(shí)兩側(cè)的宿主蛋白以肽鍵相連[3]。蛋白質(zhì)剪接分順式和反式兩種形式。對(duì)split Ssp DnaB intein的研究表明其可介導(dǎo)非天然宿主蛋白的反式剪接反應(yīng)[4]。不同的intein之間氨基酸序列同源性較低，只在剪接部位存在直接參與剪接反應(yīng)的保守氨基酸殘基[5]。

本文選擇于CFTR cDNA緊鄰NBD2的Ser839密碼子前將其斷裂成兩部分，分別與split Ssp DnaB intein基因融合，構(gòu)建一對(duì)真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的真核細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)觀察CFTR的剪接，膜片鉗記錄細(xì)胞的 CI?電流和通道開放活性，為運(yùn)用雙AAV載體轉(zhuǎn)CFTR基因的CF基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pMST (含split Ssp DnaB intein編碼序列)由加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Liu教授實(shí)驗(yàn)室提供。含CFTR的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CFTR和幼年倉鼠腎臟細(xì)胞 (Baby hamster kidney，BHK) 由加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Linsdell教授提供。綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1和黃色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒EYFP-N1購(gòu)自Clontech公司。內(nèi)切酶、DNA連接酶試劑盒為New England Biolabs公司產(chǎn)品。高保真Pfu Turbo DNA聚合酶購(gòu)自Stratagene公司。Gel Extraction Kit、PCR Purification Kit、Spin Miniprep Kit為 Qiagen公司產(chǎn)品。DMEM 和Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。山羊抗人CFTR的N端和C端抗體N-20和C-19購(gòu)自Santa Cruz公司。兔抗山羊HRP-二抗和ECL plus Western Blotting Detection試劑盒購(gòu)自 Amersham Pharmacia Biotech (GE) 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純，電生理實(shí)驗(yàn)所用試劑除注明外均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

考慮到 intein下游剪接位點(diǎn)附近氨基酸組成對(duì)剪接反應(yīng)的影響，選擇于CFTR的TMD2后與Ssp DnaB intein天然宿主蛋白具有2個(gè)相同殘基的Ser839Ile840前斷裂CFTR。用Pfu Turbo DNA聚合酶、引物P1和P2進(jìn)行PCR從pIRES2-EGFP-CFTR擴(kuò)增CFTR的N端編碼序列，用引物P3和P4從pMST擴(kuò)增split Ssp DnaB intein N端106個(gè)氨基酸 (IntN)的編碼序列，分別用Pst I/Nsi I和Nsi I/BamH I酶切2種 PCR產(chǎn)物，與 EcoR I/BamH I酶切的載體pEGFP-N1連接，得到CFTR的N端與IntN的融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-NInt。用P5、P6和P7、P8引物對(duì)分別從pMST和pIRES2-EGFP-CFTR擴(kuò)增split Ssp DnaB intein的C端48個(gè)氨基酸 (IntC) 的編碼序列和CFTR的C端編碼序列，分別用EcoR I/ApaL I和ApaL I/BamH I酶切，與EcoR I/BamH I酶切的載體pEYFP-N1連接，得到IntC與CFTR的C端的融合表達(dá)質(zhì)粒pEYFP-IntC。同時(shí)構(gòu)建CFTR的N端和C端表達(dá)載體 pEGFP-N和 pEYFP-C以及全長(zhǎng)CFTR的表達(dá)載體pEGFP-CFTR作為對(duì)照，構(gòu)建作為所用引物及序列見表1，由上海生工公司合成。

表1 構(gòu)建載體所用寡核苷酸引物及序列Table 1 Primers and sequences used in vector construction

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染

BHK細(xì)胞于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天用胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞于2 mL DMEM 培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于含蓋玻片的 6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%以上時(shí)，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體按試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2種質(zhì)粒pEGFP-NInt和pEYFP-IntC按1∶1比率各4 μg混合稀釋于250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液，與室溫放置5 min的含20 μL脂質(zhì)體的250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液混合后繼續(xù)室溫放置20 min，共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，同時(shí)，用4 μg的pEGFP-N和pEYFP-C共轉(zhuǎn)染并分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。用4 μg的pEGFP-CFTR作為陽性對(duì)照、4 μg的質(zhì)粒載體pEGFP-N1作為陰性對(duì)照 (Mock) 轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。培養(yǎng)箱內(nèi)溫育5 h后換以2 mL的新鮮Opti-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于Western blotting檢測(cè)。用作電生理記錄的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染于底部放置蓋玻片的培養(yǎng)板，使細(xì)胞貼壁于玻片生長(zhǎng)。

1.4 Western blotting觀察CFTR蛋白的剪接

將胰蛋白酶消化收集的細(xì)胞，液氮3 min、37℃3 min反復(fù)凍融3次，提取細(xì)胞總蛋白。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，取12 μg總蛋白上樣進(jìn)行還原性SDS-PAGE，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白印跡至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，用1∶1 000稀釋的CFTR抗體N-20或C-19于37℃輕搖孵育1 h，用HRP-抗山羊血清37℃輕搖孵育1 h，ECL plus法曝光X膠片。

1.5 膜片鉗記錄

熒光顯微鏡下觀察于蓋玻片貼壁生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因BHK細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)基因所帶有的熒光蛋白基因的表達(dá)，選擇熒光強(qiáng)度高且在細(xì)胞膜上表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行記錄。全細(xì)胞膜片鉗記錄參照筆者以前報(bào)道的方法進(jìn)行[6]，細(xì)胞浴池液 (細(xì)胞外液) 的成分及濃度為：140 mmol/L HCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L N-羥甲基-2-氨基乙醇磺酸 (TES)；電極液 (細(xì)胞內(nèi)液)的成分及濃度為：110 mmol/L天冬氨酸，30 mmol/L HCl，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L TES，1 mmol/L MgATP，0.1 mmol/L EGTA。兩種液體均用N-甲基-D-葡糖胺調(diào)至 pH 7.4。用電極吸附細(xì)胞獲得全細(xì)胞構(gòu)型后，記錄背景電流，然后滴加以下混合液至細(xì)胞浴池中激活CFTR通道蛋白：2 μmol/L 毛喉素，100 μmol/L 8-(4-氯酚硫-3′，5′-環(huán)腺苷酸 (pCPT-cAMP)，100 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)。單通道膜片鉗記錄參照筆者以前報(bào)道的方法進(jìn)行[7]。電極液(細(xì)胞外液) 和細(xì)胞浴池液 (細(xì)胞內(nèi)液) 的成分和濃度為：150 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L TES，用 NaOH調(diào) pH至 7.4。形成內(nèi)面向外式(Inside-out membrane patches) 記錄結(jié)構(gòu)后，在細(xì)胞浴浴滴中加以下溶液激活 CFTR通道蛋白：蛋白激酶A催化亞基 (PKA，80~120 nmol/L，Promega公司產(chǎn)品) 和1 mmol/L MgATP。

細(xì)胞電流以2 kHz (全細(xì)胞) 或50 Hz (單通道)的低頻過濾，用pCLAMP8軟件 (Axon instrument)進(jìn)行分析。用 pCLAMP8軟件測(cè)得的平均全細(xì)胞電容為 (25.9±1.7) pF (n=19)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 斷裂CFTR基因與intein融合真核表達(dá)載體的構(gòu)建

Intein剪接反應(yīng)除了其本身剪接位點(diǎn)的保守性氨基酸參與，還有賴于緊臨下游剪接位點(diǎn)的宿主蛋白的保守性氨基酸殘基，即Ser、Cys或Thr，選擇與Ssp DnaB intein下游天然宿主蛋白第1個(gè)殘基相同的 Ser839前斷裂 CFTR，分別與 split Ssp DnaB intein融合，插入pEGFP-N1和pEYFP-N1，得到1對(duì)融合intein的CFTR兩段基因并于3′末端分別帶有綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白基因的真核表達(dá)載體pEGFP-NInt和pEYFP-IntC，如圖1所示。所構(gòu)建的載體經(jīng)酶切電泳進(jìn)行鑒定并通過 DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 CFTR蛋白表達(dá)和剪接的Western blotting結(jié)果

圖1 斷裂CFTR基因與intein融合重組基因結(jié)構(gòu)及剪接示意圖Fig. 1 Schematic representation of recombinant intein-fused split CFTR genes and splicing. The split CFTR half genes severed between Glu838-Ser839 were fused with intein respectively. These two fused genes are inserted into pEGFP and pEYFP vectors separately under the control of CMV promoter/enhancer with EGFP and EYFP following their C termili. The separately expressed CFTR half proteins would be ligated to an intact CFTR protein under the intein-mediated protein trans-splicing.

細(xì)胞總蛋白Western blotting分別用CFTR的N末端抗體 (N-20) 和 C末端抗 (C-19) 體檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-CFTR的BHK細(xì)胞可見明顯融合有EGFP的CFTR蛋白條帶 (195 kDa)，Mock轉(zhuǎn)染細(xì)胞未見 CFTR蛋白條帶，共轉(zhuǎn)染pEGFP-NInt和pEYFP-IntC的細(xì)胞用兩種抗體均可見一明顯的與陽性對(duì)照同樣大小的剪接形成的CFTR蛋白條帶，同時(shí)可見未完全剪接的 intein融合蛋白前體 NInt和 IntC。共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N和pEYFP-C的細(xì)胞只可見分別表達(dá)的CFTR的N端蛋白和 C端蛋白，另外，單獨(dú)轉(zhuǎn)染 pEGFP-N或pEYFP-C的細(xì)胞可見表達(dá)的CFTR的N端蛋白或C端蛋白 (圖2)。

圖2 檢測(cè)CFTR表達(dá)和剪接的Western blotting印跡結(jié)果Fig. 2 Western blotting assay of CFTR expression and splicing. (A, B) The antibodies against CFTR N-terminus (N-20) and C-terminus (C-19) were used as probes respectively. 1 and 6: mock control; 2 and 7: positive control of wild type CFTR gene transfection; 3 and 8: NInt and IntC co-transfection; 4 and 9: N and C co-transfection; 5: N transfection alone; 10: C transfection alone. N-C: ligated CFTR by protein trans-splicing; NInt and IntC: non-spliced precursor peptides; CFTR-N and CFTR-C: expressed CFTR N and C termini.

2.3 電生理記錄結(jié)果

全細(xì)胞電壓鉗模式下記錄的Cl?電流顯示，陽性對(duì)照轉(zhuǎn)染wtCFTR的BHK細(xì)胞經(jīng)cAMP激活后，記錄到較大的 Cl?電流，而 Mock轉(zhuǎn)染細(xì)胞未記錄到Cl?電流，NInt+IntC共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞可記錄到明顯的Cl?電流，表明intein的蛋白質(zhì)反式剪接產(chǎn)生的完整CFTR蛋白具有與wtCFTR相似的Cl?通道功能，而N+C共轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可記錄到低水平的Cl?電流，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染N或C端基因的細(xì)胞未記錄到Cl?電流，說明兩段 CFTR蛋白盡管沒有 intein介導(dǎo)的共價(jià)連接，也可通過某種機(jī)制形成一定的Cl?通道功能 (圖3)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)電壓為?60 mV時(shí)，根據(jù)細(xì)胞膜電容進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到的電流密度 (用pA/pF表示) (每組n=4)，陽性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞 (wtCFTR) 經(jīng)cAMP激活后的電流密度為 495±76，NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞為445±68，二者無顯著差異 (P＞0.05)，而 N+C共轉(zhuǎn)染細(xì)胞為225±34，與NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比明顯要小 (P＜0.05) (圖4)。

內(nèi)面向外式 (Inside-out) 單通道膜片鉗記錄結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染NInt+IntC的BHK細(xì)胞表現(xiàn)的PKA和ATP依賴性Cl?通道開放活性類似于wtCFTR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞 (圖5A)；據(jù)此記錄計(jì)算的NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均通道開放概率為0.39±0.05，轉(zhuǎn)wtCFTR為0.42±0.03，二者相比差別無顯著意義 (P＞0.05)，而明顯高于N+C共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的0.098±0.01 (P＜0.01) (圖5B)。

3 討論

圖3 全細(xì)胞模式記錄的轉(zhuǎn)基因BHK細(xì)胞Cl?電流Fig. 3 Recording of whole cell CFTR Cl? currents in gene transfected BHK cells. The cells expressing EGFP alone control or EGFP-fused wtCFTR were set as mock (left top) or positive control (left middle). The whole cell currents of cells coexpressing NInt+IntC (left bottom), N+C (right top), individual N (right middle) or C part (right bottom) of CFTR were recorded both before (Control) and after (+cAMP) addition of forskolin (2 μmol/L), pCPT-cAMP (100 μmol/L) and IBMX (100 μmol/L) to the bath solution. Voltage steps were from ?60 mV to +60 mV in 20 mV increments from a holding potential of -14.

圖4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的電流密度Fig. 4 Current density of gene transferred BHK cells. Mean cAMP-activated current density was measured at ?60 mV from experiments such as those shown in Fig. 3. Mean of data from 4 patches in each case. * P>0.05 vs wtCFTR group, **P<0.01 vs NInt+IntC group.

圖5 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞單CFTR通道門控特征Fig. 5 Gating properties of single CFTR channel from gene transferred cells. (A) Unitary currents recorded from inside-out membrane patches at a membrane potentials of ?50 mV (C means channel closed and O means channel open). (B) Mean channel open probability estimated from such recordings lasting at least 60 s. * P>0.05 vs wtCFTR group, ** P<0.01 vs NInt+IntC group.

通過于Ser839前斷裂的CFTR與split Ssp DnaB intein融合的雙載體培養(yǎng)的BHK細(xì)胞基因共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，翻譯后 intein的蛋白質(zhì)反式剪接作用使分別表達(dá)的CFTR兩段多肽連接成完整的CFTR蛋白，并且較好地恢復(fù)了Cl?通道功能，表明intein可作為一種技術(shù)手段進(jìn)行雙載體系統(tǒng)的 CFTR基因轉(zhuǎn)移。Intein的蛋白質(zhì)剪接作用包括4步反應(yīng)，直接參與剪接反應(yīng)的保守性氨基酸殘基位于 intein與宿主蛋白的交界處，即上游剪接位點(diǎn) intein的第 1個(gè)殘基、下游剪接位點(diǎn)的 intein的最后 1個(gè)殘疾和與之緊鄰的宿主蛋白首個(gè)殘基，蛋白質(zhì)剪接的特點(diǎn)在于其不依賴細(xì)胞機(jī)制，也不需要消耗能量，是 1個(gè)完全自發(fā)的過程[8]。盡管如此，在滿足剪接部位保守性氨基酸殘基組成的前提下，Intein對(duì)不同的外源蛋白表現(xiàn)出不同的剪接效率，說明剪接位點(diǎn)附近特別是下游外源蛋白的其他殘基對(duì)剪接反應(yīng)的影響，因此，本研究所選擇的CFTR斷裂點(diǎn)的Ser839后為Ile840，這2個(gè)殘基與所用intein下游天然宿主蛋白相同，共轉(zhuǎn)染后的Western blotting結(jié)果顯示，Intein對(duì)此斷裂點(diǎn)的兩段CFTR多肽可進(jìn)行有效剪接，但仍可檢測(cè)到未被完全剪接的前體蛋白，可能的原因?yàn)榧艚臃磻?yīng)本身的不完全，或者兩種基因轉(zhuǎn)染效率和/或表達(dá)水平的不均衡性所致。電生理結(jié)果顯示，剪接所形成的CFTR蛋白具有與野生型CFTR相似的Cl?通道功能，全細(xì)胞膜片鉗記錄到較高的cAMP依賴性Cl?電流和較高的電流密度，單通道膜片鉗記錄到較高的PKA和ATP依賴性Cl?通道開放活性和開放概率，應(yīng)該注意的是，雖然蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出CFTR的不完全剪接，但剪接產(chǎn)生的完整CFTR蛋白足以形成與野生型 CFTR相近的 Cl?通道功能。未融合intein的兩段CFTR基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果顯示，盡管不能形成完整的 CFTR蛋白分子，亦可記錄到較低的Cl?電流，從單獨(dú)轉(zhuǎn)染CFTR的N端基因說明，兩段CFTR蛋白存在某種程度的分子間互補(bǔ)作用，并由此產(chǎn)生部分的Cl?通道電流，但大小和密度明顯低于融合 intein的共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而且通道開放活性和概率也明顯較低。最近有研究者用基于RNA剪接的雙AAV載體轉(zhuǎn)CFTR基因，但由于剪接效率不夠高使得其使用受到限制[9]。

由于蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)的精確、無副反應(yīng)的特點(diǎn)，近年來在蛋白質(zhì)純化[10]、多肽環(huán)化[11]以及蛋白質(zhì)相互作用[12]等研究中得到應(yīng)用。需要指出的是，盡管intein對(duì)其天然宿主蛋白的剪接效率極高，甚至觀察不到中間產(chǎn)物，但對(duì)不同的非天然宿主蛋白，表現(xiàn)出的剪接效率高低不一，因此對(duì)于不同的目的蛋白需要測(cè)試不同的滿足剪接反應(yīng)的保守氨基酸殘基的斷裂位點(diǎn)，筆者曾在大腸桿菌表達(dá)實(shí)驗(yàn)中證明本文中所選擇的斷裂位點(diǎn)以及于 Ser660前斷裂 CFTR，Ser660后亦為保守的Ile661，Intein表現(xiàn)出較高的剪接效率[13]，但對(duì)另一有 2個(gè)保守殘基 Ser707Ile708前斷裂的CFTR只觀察到很低的剪接效率，對(duì)只有一個(gè)保守殘基Ser670或Ser737前斷裂的CFTR沒有觀察到剪接反應(yīng) (數(shù)據(jù)未顯示)。最近筆者還用 intein在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血VIII因子的高效剪接[14]。有報(bào)道用 intein的蛋白質(zhì)反式剪接功能肌肉注射雙AAV載體轉(zhuǎn)Dystrophin基因后的肌肉形態(tài)學(xué)證明對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠有較好的治療效果[15]。

鑒于AAV5對(duì)感染呼吸道上皮細(xì)胞的靶向特異性感染的特點(diǎn)，Sirninger等構(gòu)建了一種去除 TMD1的263個(gè)氨基酸殘基的縮減型CFTR基因的重組型AAV5，Cftr?/?小鼠氣管內(nèi)轉(zhuǎn)基因顯示對(duì)Cl?通道電流的糾正作用，并改善病菌感染引起的炎癥[16]。本研究為進(jìn)一步地應(yīng)用雙AAV5載體的全長(zhǎng)CFTR基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行CF基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Liu教授提供的蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的幫助和Paul Linsdell教授提供的膜片鉗技術(shù)幫助。

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