葉愛(ài)華，張寬亮1,，陳宗梅1,，榮亮1,，汪苗1,，范軍1,

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 省級(jí)作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036 2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036

生物四吡咯分子，如血紅素、葉綠素、維生素B12和西羅血紅素，合成的共有途徑中第一個(gè)中間物是5-氨基乙酰丙酸 (5-Aminolevulinic acid，ALA)。在動(dòng)物、真菌和光合細(xì)菌中，ALA由ALA合酶催化；在植物和大部分微生物中，ALA來(lái)自谷氨酸的碳骨架。首先合成谷氨酰tRNA，隨后，它被還原酶催化生成谷氨酸-1-半醛 (Glutamate-1-semiadhyde，GSA)，谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶 (GSA aminotransferase，GSAT) 催化GSA分子內(nèi)轉(zhuǎn)氨合成ALA。從ALA到尿卟啉原Ⅲ是所有生物合成四吡咯分子的共有途徑，尿卟啉原Ⅲ的轉(zhuǎn)化有 2個(gè)分支反應(yīng)，一條途徑最終合成血紅素和葉綠素等卟啉類(lèi)化合物；另一條途徑由尿卟啉原甲基化酶(Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase ，UPMT) 催化，最終合成西羅血紅素和維生素B12等卟吩烷化合物。其中，ALA合成和UPMT催化的反應(yīng)是四吡咯分子合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)[1]。

大腸桿菌GSAT由hemL基因編碼，一旦突變導(dǎo)致功能喪失，細(xì)菌的生長(zhǎng)依賴(lài)于體外添加ALA，否則細(xì)胞死亡[2]。重組純化的大腸桿菌 GSAT活性被3-氨基-2,3二羥基苯甲酸抑制[3]。谷氨酰tRNA還原酶是ALA合成的關(guān)鍵酶，受血紅素的反饋抑制，它和 GSAT相互作用，調(diào)節(jié) ALA合成[4]。聚胞藻Synechococcus GSAT突變蛋白對(duì)抑制劑不敏感[5]，其編碼基因作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選標(biāo)記[6-7]。

細(xì)菌UPMT的基因命名較多，主要有cobA和CysGA等。大腸桿菌重組表達(dá) cobA基因，細(xì)胞積累催化產(chǎn)物，菌落在紫外光照射下顯示強(qiáng)烈紅色熒光[8]，這種特性用于克隆細(xì)菌cobA基因以及合成尿卟啉原Ⅲ的基因簇[9-10]。cobA及其下游維生素B12合成基因在大腸桿菌共同表達(dá)，用于分析酶活性[11-12]。作為報(bào)告基因，cobA用于分析細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平[13]，根據(jù)插入失活篩選克隆外源基因的重組子[14]，以及分析細(xì)菌的基因啟動(dòng)子效應(yīng)[15]。最近發(fā)現(xiàn)，表達(dá)cobA基因可以增加大腸桿菌對(duì)碲酸鹽毒性的抵抗力[16]。

大腸桿菌表達(dá) cobA基因產(chǎn)生的紅色熒光存在熒光滯后和均一性差等缺點(diǎn)[14,17]，添加ALA能提高胞內(nèi)UPMT的活性，縮短熒光滯后時(shí)間，提高細(xì)胞的熒光強(qiáng)度[16,18]，但是會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌積累血紅素合成的中間物，對(duì)照菌落也產(chǎn)生紅色熒光[13]，此外，ALA在溶液中不穩(wěn)定[19]。目前，cobA作為報(bào)告基因的影響因子研究報(bào)道較少。由于GSAT和UPMT兩個(gè)都是標(biāo)記蛋白，分別位于西羅血紅素合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，因此，它們之間的協(xié)調(diào)作用需要深入研究。

大腸桿菌僅含有血紅素和西羅血紅素，表達(dá)ALA合成相關(guān)的酶，增加細(xì)胞內(nèi) ALA以及尿卟啉原Ⅲ含量[20-21]，但表達(dá)GSAT的胞內(nèi)效應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。此前，筆者發(fā)現(xiàn)純化的玉米UPMT結(jié)合其催化的紅色熒光產(chǎn)物，而純化的一些細(xì)菌UPMT不結(jié)合，表明玉米UPMT更適合作為報(bào)告蛋白，用于體外分析[22]。本研究中，將大腸桿菌GSAT和玉米UPMT共同表達(dá)，研究GSAT對(duì)報(bào)告蛋白UPMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和試劑

本研究保存的質(zhì)粒見(jiàn)表 1，大腸桿菌菌株XL-Blue和 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，酵母浸出物和胰蛋白胨是英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)購(gòu)自美國(guó) Promega公司，3-氨基-2,3二羥基苯甲酸(Gabaculine)、DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA是美國(guó) Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，Strep-tag抗體和His-tag抗體是美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品，其他分子生物學(xué)試劑為大連寶生物公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度儀 U-2001和高速冷凍離心機(jī)SCR20BC是日本Hitachi公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)由日本Kodark公司生產(chǎn)，蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)移裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

CTAB法提取大腸桿菌基因組DNA，以此為模板，擴(kuò)增 hemL基因，引物見(jiàn)表 1，擴(kuò)增產(chǎn)物插入pUC-18T 載體，測(cè)序。采用同義突變?nèi)コ齢emL基因內(nèi)Nco I作用序列，PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性?xún)?nèi)切酶DpnⅠ消化12 h，除去模板，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue，挑選克隆，測(cè)序。PCR擴(kuò)增玉米u(yù)pmt基因，產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)后純化，用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶作用，再純化。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建的載體及命名見(jiàn)表 2。將擴(kuò)增的玉米 upmt基因插入pET Duet-1質(zhì)粒第2個(gè)順?lè)醋?，?gòu)建pETU載體；將大腸桿菌hemL基因插入pET-51b質(zhì)粒，構(gòu)建p51eG載體；NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切p51eG質(zhì)粒的hemL基因，插入 pETU質(zhì)粒第 1個(gè)順?lè)醋?，?gòu)建pETeGU載體。

1.2.3 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)

不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)，在LB培養(yǎng)基中加入100 μg/mL的氨芐青霉素，37℃培養(yǎng)12 h，按照1∶200稀釋?zhuān)w濃度生長(zhǎng)至OD600約為0.5時(shí)，加入IPTG，終濃度為0.4 mmol/L，37℃誘導(dǎo)5 h，6 000×g離心10 min收集菌體，超聲破碎，加入裂解緩沖液 (100 mmol/L的Tris-HCl，pH 8.0)，超聲破碎，15 000×g離心30 min，棄沉淀，上清液備用。

表1 PCR擴(kuò)增引物及序列Table 1 PCR primers used in this study

表2 本研究所用載體Table 2 Plasmids used in this study

1.2.4 蛋白分析

蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法，以BSA作對(duì)照。蛋白 SDS-PAGE分析，分離膠為12.5%，電泳完畢后轉(zhuǎn)移到 PVDF膜，轉(zhuǎn)移效果用麗春紅顯示，1×TBS/0.2% 戊二醛固定40 min，加10 mL封閉液封閉1 h阻斷非特異性結(jié)合部位，分別加入10 μL 按1∶2 000稀釋的Strep·TagⅡ或者組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體，室溫孵育過(guò)夜。Western漂洗液漂洗3次，加10 mL封閉液及按1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記第二抗體10 μL，孵育1 h后漂洗3次，加1 mL化學(xué)發(fā)光劑，置入暗室用X光膠片曝光，然后顯影，定影。

1.2.5 重組細(xì)胞的熒光色素分析[22]

不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，在LB固體培養(yǎng)基上37℃生長(zhǎng)15 h，長(zhǎng)紫外光下觀察菌落熒光。pETeGU質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在1 L LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，破碎細(xì)胞，上清液用DEAE-Sepharose CL-6B (3 cm×3 cm) 吸附，裂解緩沖液沖洗5個(gè)柱體積，加入20 mL的洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，3 mol/L NaCl) 洗脫，立即進(jìn)行300~700 nm光譜掃描。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增及突變

利用NEBcutter V2.0軟件預(yù)測(cè)基因的限制性?xún)?nèi)切酶作用序列，設(shè)計(jì)不同引物 (表 1)，分別擴(kuò)增不同基因。根據(jù)Expasy中Translate tool軟件分析大腸桿菌hemL基因編碼的氨基酸序列，采用同義突變技術(shù)去除hemL基因的Nco I序列，引物突變序列不改變大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性。

利用PCR技術(shù)，從大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出hemL基因，約1.3 kb (圖 1)，測(cè)序結(jié)果和公布的序列一致，由于在pET-51b質(zhì)粒表達(dá)的蛋白N端含有Strep·TagⅡ標(biāo)簽，所以表達(dá)的GSAT刪除第1個(gè)Met殘基。

以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有玉米u(yù)pmt基因p31S1載體為模板 (表2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物約為880 bp (圖2)，編碼N端組氨酸標(biāo)簽和玉米UPMT的Leu91-Ser363。玉米 UPMT前體含有葉綠體導(dǎo)肽，刪除 N端和C端一段氨基酸序列，對(duì)其功能影響不大[22]。

圖1 大腸桿菌hemL的PCR擴(kuò)增Fig. 1 Escherchia coli hemL gene obtained by PCR. 1: DL5000 DNA marker; 2: E. coli hemL gene.

圖2 玉米u(yù)pmt基因的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR analysis of maize upmt gene encoding Leu91-Ser363 amino acid sequence with His6-tag at N terminus. 1: DL2000 DNA marker; 2: maize upmt gene.

2.2 載體構(gòu)建

本研究構(gòu)建數(shù)個(gè)載體 (表 2) 用于基因克隆和表達(dá)。分別把大腸桿菌hemL基因和玉米u(yù)pmt基因插入pET Duet -1質(zhì)粒的第1和第2個(gè)順?lè)醋?，表達(dá)重組蛋白分別含有Strep·TagⅡ和組氨酸標(biāo)簽。N端組氨酸標(biāo)簽對(duì)大腸桿菌GSAT和玉米UPMT的活性沒(méi)有影響[4,22]。

2.3 GSAT和UPMT蛋白在大腸桿菌的表達(dá)水平

分別轉(zhuǎn)化 pETU質(zhì)粒和 pETeGU質(zhì)粒，重組UPMT的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化 (圖 3)，同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌GSAT也能高效表達(dá)，表明pETDuet-1質(zhì)粒的2個(gè)表達(dá)單元中每個(gè)啟動(dòng)子對(duì)下游基因的表達(dá)都起作用。

圖3 UPMT和GSAT的可溶性蛋白印跡分析Fig. 3 Western blotting analysis of the soluble UPMT and GSAT. Lane 1 and 2 represented the expression of UPMT extracted from the induced E. coli BL21 (DE3) cells carrying pETU plasmid or pETeGU plasmid. Lane 3 represented the expression of GSAT from the induced cells carrying pETeGU plasmid.

2.4 表達(dá)GSAT和UPMT對(duì)菌落熒光的影響

將pETU質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)，菌落不顯示紅色熒光，但是誘導(dǎo)后菌落顯示紅色熒光 (表3)。無(wú)論重組pUC18質(zhì)粒中Lac啟動(dòng)子下的細(xì)菌cobA基因，還是重組pQE31質(zhì)粒中T5啟動(dòng)子下的玉米u(yù)pmt基因，其本底表達(dá)導(dǎo)致菌落顯示紅色熒光[13,22]，表明菌株和質(zhì)粒的不同啟動(dòng)子導(dǎo)致UPMT的表達(dá)存在差異。

含有pETeGU質(zhì)粒的大腸桿菌依賴(lài)UPMT的本底表達(dá)，菌落顯示紅色熒光。誘導(dǎo)后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于轉(zhuǎn)化pETU質(zhì)粒細(xì)胞的強(qiáng)度 (表3)，由于兩種重組細(xì)胞中UPMT的表達(dá)水平接近 (圖3)，推測(cè)表達(dá)GSAT促進(jìn)ALA的合成，提高細(xì)胞內(nèi)尿卟啉原Ⅲ水平。

表3 轉(zhuǎn)化不同載體的重組大腸桿菌熒光展示Table 3 Fluorescent display from the recombinant E. coli carrying the different plasmid respectively

2.5 GSAT的抑制劑對(duì)誘導(dǎo)的重組菌落熒光的影響

添加2 mmol/L的GSAT抑制劑3-氨基-2,3二羥基苯甲酸，表達(dá)GSAT和UPMT的重組菌落熒光消失 (圖 4)。該抑制劑能穿過(guò)大腸桿菌細(xì)胞，抑制ALA合成，同時(shí)對(duì)重組聚胞藻GSAT和橙色綠屈撓菌 Chloroflexus aurantiacus蛋白的表達(dá)基本沒(méi)有影響[5,23]，可能ALA合成被抑制，尿卟啉原Ⅲ的含量降低，導(dǎo)致熒光消失，不加抑制劑的菌落顯示強(qiáng)烈紅色熒光，表明增強(qiáng)胞內(nèi)ALA的合成比在體外添加ALA對(duì)UPMT的熒光效果好。大腸桿菌hemB-突變體不能合成尿卟啉原Ⅲ，表達(dá)UPMT后，菌落不顯示紅色熒光[24]，表明UPMT的熒光依賴(lài)內(nèi)源底物尿卟啉原Ⅲ的含量。

2.6 重組細(xì)胞的熒光物質(zhì)分析

轉(zhuǎn)化pETeGU質(zhì)粒的重組細(xì)胞呈紅色，光譜掃描純化的上清液，顯示在354 nm和378 nm有2個(gè)吸收峰 (圖 5)，分別是三甲基咕啉和西羅雙氫葉綠三酸的特異光吸收，是重組UPMT催化產(chǎn)生的主要熒光物質(zhì)[8]，這和表達(dá)玉米UPMT的結(jié)果一致[22]。體外添加 ALA能增加血紅素合成中間物卟啉原的含量，它們?nèi)菀籽趸a(chǎn)生尿卟啉和糞卟啉等化合物，在405 nm有吸收峰[21]，本研究并未檢測(cè)到，可能是重組GSAT對(duì)提高ALA合成的能力有限，以及重組表達(dá)UPMT導(dǎo)致大腸桿菌尿卟啉原Ⅲ的代謝流向發(fā)生改變。

圖4 濃度為2 mmol/L的3-氨基-2,3二羥基苯甲酸對(duì)誘導(dǎo)含有pETeGU質(zhì)粒的大腸桿菌菌落熒光的影響Fig. 4 The effect of gabaculine at the concentration of 2 mmol/L on the red fluorescence from the induced colonies harboring pETeGU plasmid on LB agar plate upon UV light illumination.

圖5 轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的大腸桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞破碎上清液的光譜掃描，圖上標(biāo)注為轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱(chēng)Fig. 5 UV-visible spectra of the extracts from the induced E. coli cells carrying the different plasmids (denoted on the figure). The specific absorption at 354 nm and 378 nm represent trimethylpyrrocophin and sirohydrochlorin respectively.

3 討論

本研究中，我們選擇了具有雙順?lè)醋拥妮d體，每個(gè)順?lè)醋佣加凶约邯?dú)立的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，選擇表達(dá)的蛋白標(biāo)簽序列較短，避免抑制酶活性，便于檢測(cè)。由于GSAT活性測(cè)定誤差較大[25]；以及尿卟啉原Ⅲ和UPMT的催化產(chǎn)物難以區(qū)分[24]，我們沒(méi)有分析重組 GSAT的比活和胞內(nèi)尿卟啉原Ⅲ的含量。

UPMT作為指示蛋白，從理論上推測(cè)，其熒光強(qiáng)度可能與蛋白表達(dá)水平、內(nèi)源底物濃度、熒光產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及表達(dá)系統(tǒng)有關(guān)[13]，表達(dá)UPMT導(dǎo)致代謝流向改變，可能降低大腸桿菌血紅素含量，解除了它對(duì)谷氨酰 tRNA還原酶的反饋抑制[14]。本研究中，表達(dá)大腸桿菌GSAT，可能提高ALA合成能力，ALA被大腸桿菌基因組編碼的合成血紅素一些酶轉(zhuǎn)化成尿卟啉原Ⅲ[21]，它被重組表達(dá)的UPMT催化，從而提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

血紅素合成的一些卟啉類(lèi)中間物，例如尿卟啉原Ⅲ，可以作為治療癌癥的藥物[21]。大腸桿菌高效合成尿卟啉原Ⅲ，需要重組表達(dá) 4個(gè)酶，不同蛋白的表達(dá)水平差異導(dǎo)致細(xì)胞的尿卟啉原Ⅲ濃度不同，需要重組細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)和HPLC技術(shù)分析才能確定[21]，已發(fā)現(xiàn)，體外添加ALA濃度和大腸桿菌表達(dá)UPMT產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度成正相關(guān)[15]，UPMT能否檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)尿卟啉原Ⅲ的含量，有待進(jìn)一步研究。

植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，氨基糖苷-3′-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的 aadA基因和綠色熒光蛋白的基因位于一個(gè)雙順?lè)醋?，作為雙功能標(biāo)記用于轉(zhuǎn)基因后代的篩選和檢測(cè)[26]。甜菜堿醛脫氫酶基因不僅作為質(zhì)體轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記，還提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性[27]。植物在葉綠體中不但合成四吡咯分子，而且合成類(lèi)胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因玉米的類(lèi)胡蘿卜素含量隨著轉(zhuǎn)化基因數(shù)目增加而升高[28]。西羅血紅素作為植物亞硝酸還原酶和亞硫酸還原酶的輔基，參與植物氮和硫的同化，亞硝酸鹽誘導(dǎo)玉米幼苗中 upmt基因的表達(dá)[29]。GSAT和UPMT作為西羅血紅素合成2個(gè)關(guān)鍵蛋白，它們的編碼基因能否在轉(zhuǎn)基因植株中作為標(biāo)記并增加西羅血紅素的產(chǎn)量，正在深入研究。

REFERENCES

[1] Warren MJ, Bolt E, Woodcock SC. 5-Aminolaevulinic acid synthase and uroporphyrinogen methylase: two key control enzymes of tetrapyrrole biosynthesis and modification. Ciba Found Symp, 1994, 180: 26?40.

[2] Wang LY, Brown L, Elliott M, et al. Regulation of heme biosynthesis in Salmonella typhimurium: activity of glutamyl-tRNA reductase (HemA) is greatly elevated during heme limitation by a mechanism which increases abundance of the protein. J Bacteriol, 1997, 179(9): 2907?2914.

[3] Ilag LL, Jahn D, Eggertsson G, et al. The Escherichia coli hemL gene encodes glutamate 1-semialdehyde aminotransferase. J Bacteriol, 1991, 173(11): 3408?3413.

[4] Lüer C, Schauer S, M?bius K, et al. Complex formation between glutamyl-tRNA reductase and glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase in Escherichia coli during the initial reactions of porphyrin biosynthesis. J Biol Chem, 2005, 280(19): 18568?18572.

[5] Smith MA, Grimm B. Gabaculine resistance of Synechococcus glutamate 1-semialdehyde aminotransferase. Biochemistry, 1992, 31(16): 4122?4127.

[6] Rosellini D, Capomaccio S, Ferradini N, et al. Non-antibiotic, efficient selection for alfalfa genetic engineering. Plant Cell Rep, 2007, 26(7): 1035?1044.

[7] Gough KC, Hawes WS, Kilpatrick J, et al. Cyanobacterial GR6 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase: a novel enzyme-based selectable marker for plant transformation. Plant Cell Rep, 2001, 20(4): 296?300.

[8] Warren MJ, Stolowich NJ, Santander PJ, et al. Enzymatic synthesis of dihydrosiro- hydrochlorin (precorrin-2) and of a novel pyrrocorphin by uroporphyrinogen Ⅲ methylase. FEBS Lett, 1990, 261(1): 76?80.

[9] Lan XQ, Sato K, Taguchi G, et al. Characterization of a gene conferring red fluorescence isolated from an environmental DNA library constructed from soil bacteria. Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72(7): 1908?1914.

[10] Anderson PJ, Entsch B, McKay DB. A gene, cobA + hemD, from Selenomonas ruminantium encodes a bifunctional enzyme involved in the synthesis of vitamin B12. Gene, 2001, 281(1/2): 63?70.

[11] Roessner CA, Park JH, Scott AI. Genetic engineering of Escherichia coli for the production of precorrin-3 in vivo and in vitro. Bioorg Med Chem, 1999, 7(10): 2215?2219.

[12] Raux E, Leech HK, Beck R, et al. Identification and functional analysis of enzymes required for precorrin-2 dehydrogenation and metal ion insertion in the biosynthesis of sirohaem and cobalamin in Bacillus megaterium. Biochem J, 2003, 370(2): 505?516.

[13] Wildt S, Deuschle U. CobA, a red fluorescent transcriptional reporter for Escherichia coli, yeast, and mammalian cells. Nat Biotech, 1999, 17(12): 1175?1178.

[14] Roessner CA. Use of CobA and CysGAas red fluorescent indicators. Methods Mol Biol, 2002, 183: 19?30.

[15] Feliciano J, Liu Y, Daunert S. Novel reporter gene in a fluorescent-based whole cell sensing system. Biotechnol Bioeng, 2006, 93(5): 989?997.

[16] Araya MA, Tantaleán JC, Pérez JM, et al. Cloning, purification and characterization of Geobacillus stearothermophilus V uroporphyrinogen-III C-methyltransferase: evaluation of its role in resistance to potassium tellurite in Escherichia coli. Res Microbiol, 2009, 160(2): 125?133.

[17] Chou PL, Ohtsuka M, Minowa T, et al. Reddish Escherichia coli cells caused by overproduction of Bacillus stearothermophilus uroporphyrinogen Ⅲmethylase: cloning, sequencing and expression of the gene. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59(10): 1817?1824.

[18] Schubert HL, Raux E, Wilson KS, et al. Common chelatase design in the branched tetrapyrrole pathways of heme and anaerobic cobalamin synthesis. Biochemistry, 1999, 38(33): 10660?10669.

[19] Kaliszewski M, Kwa?ny M, Kamiński J, et al. The stability of 5-aminolevulinic acid and its ester derivatives. Acta Pol Pharm, 2004, 61(1): 15?19.

[20] Verderber E, Lucast LJ, Van Dehy JA, et al. Role of the hemA gene product and delta-aminolevulinic acid in regulation of Escherichia coli heme synthesis. J Bacteriol, 1997, 179(14): 4583?4590.

[21] Kwon SJ, de Boer AL, Petri R, et al. High-level production of porphyrins in metabolically engineered Escherichia coli: systematic extension of a pathway assembled from overexpressed genes involved in heme biosynthesis. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4875?4883.

[22] Fan J, Wang DQ, Liang Z, et al. Maize uroporphyrinogen III methyltransferase: overexpression of the functional gene fragments in Escherichia coli and one-step purification. Protein Expr Purif, 2006, 46(1): 40?46.

[23] Oelze J. Light and oxygen regulation of the synthesis of bacteriochlorophylls a and c in Chloroflexus aurantiacus. J Bacteriol, 1992, 174(15): 5021?5026.

[24] Warren MJ, Bolt EL, Roessner CA, et al. Gene dissection demonstrates that the Escherichia coli cysG gene encodes a multifunctional protein. Biochem J, 1994, 302(3): 837?844.

[25] Pugh CE, Nair SP, Harwood JL, et al. Conditions for the assay of glutamate semialdehyde aminotransferase that overcome the problem of substrate instability. Anal Biochem, 1991, 198(1): 43?46.

[26] Jeong SW, Jeong WJ, Woo JW, et al. Dicistronic expression of the green fluorescent protein and antibiotic resistance genes in the plastid for selection and tracking of plastid-transformed cells in tobacco. Plant Cell Rep, 2004, 22(10): 747?751.

[27] Kumar S, Dhingra A, Daniell H. Plastid-expressed betaine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells, roots, and leaves confers enhanced salt tolerance. Plant Physiol, 2004, 136(1): 2843?2854.

[28] Zhu CF, Naqvi S, Breitenbach J, et al. Combinatorial genetic transformation generates a library of metabolic phenotypes for the carotenoid pathway in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(47): 18232-18237.

[29] Sakakibara H, Takei K, Sugiyama T. Isolation and characterization of a cDNA that encodes maize uroporphyrinogen III methyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of siroheme, which is prosthetic group of nitrite reductase. Plant J, 1996, 10(5): 883?892.