石秀英,房興堂,張春雷,陳 宏＊,2

(1.徐州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,江蘇徐州221116;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌712100)

1973年,Berg和Carlson等報(bào)道了一個(gè)與羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶相關(guān)的蛋白激酶,隨后的研究表明,其活性受AMP(一磷酸腺苷)的調(diào)節(jié),故稱(chēng)為AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)[1]。AMPK在真核細(xì)胞生物中廣泛存在,能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變,并通過(guò)影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量供求平衡。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),AMPK在下丘腦攝食調(diào)控中起作用,激活 AMPK促進(jìn)攝食,抑制 AMPK引起厭食[2,3]。

1 AMPK的結(jié)構(gòu)

1.1 AMPK的結(jié)構(gòu)及分布

AMPK作為能量調(diào)節(jié)器的最重要特征是它對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的高敏感性,而這種性質(zhì)是由它獨(dú)特的生化結(jié)構(gòu)決定的。1998年 Hardie等總結(jié)了AMPK的分子結(jié)構(gòu)[4]。AMPK是一個(gè)異源三聚體蛋白,由催化亞單位α和調(diào)節(jié)亞單位β、γ構(gòu)成,每個(gè)亞單位都是AMPK的活性所必需的。α和β亞單位各由兩個(gè)基因編碼(α1,α2和β1,β2),而γ亞單位則由三個(gè)基因編碼(γ1,γ2和γ3)。α亞單位的N末端是起催化作用的核心部位,含有一個(gè)典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶的催化區(qū)域,C末端則主要負(fù)責(zé)活性的調(diào)節(jié)以及聯(lián)系β和γ亞單位[5]。α1由548個(gè)氨基酸組成,其中Thr172是一磷酸腺苷激活蛋白激酶的激酶(AMPKK)磷酸化位點(diǎn),它是AMPK活性的關(guān)鍵;α2由554個(gè)氨基酸組成。α1在哺乳動(dòng)物組織中分布較為廣泛,α2主要分布在骨骼肌、心臟和肝臟中[6]。β亞單位則好似一個(gè)支架,它可把α和γ亞單位連接起來(lái)[7]。β亞單位包含兩個(gè)保守區(qū)域,分別位于中心和C端,β亞單位C末端的保守結(jié)構(gòu)域是形成三聚體的關(guān)鍵,是與α和γ亞單位結(jié)合的區(qū)域;而N末端含有N-異淀粉酶區(qū)域,稱(chēng)作糖原結(jié)合域,其功能可能與糖原對(duì)AMPK的調(diào)節(jié)有關(guān)。β1具有廣泛的組織分布性,而β2主要分布在骨骼肌、心臟和胰腺中[8]。γ亞單位有4個(gè)串行重復(fù)的CBS(胱硫醚-β-合成酶 ,cystathionine-beta-synthase)區(qū)域,每個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列由60個(gè)氨基酸構(gòu)成,被命名為CBS模序,每一對(duì)CBS結(jié)構(gòu)域可以形成一個(gè)有功能的Bateman域,可以結(jié)合一分子的AMP[9,10]。γ1和γ2分布較廣,而γ3只特異性地在骨骼肌中表達(dá)。

1.2 牛AMPK家族基因結(jié)構(gòu)特征

McKay等對(duì)牛5′AMPK基因家族7個(gè)基因進(jìn)行了研究,他們是 PRK AA1、PRK AA2、PRKAB1、PRK AB 2、PRK AG1、PRKAG2和PRKAG3,并初步將其分別定位于牛 20、3、17 、3、5 、4和2號(hào)染色體上[11]。牛PRKAB1共有7個(gè)外顯子,編碼的氨基酸全長(zhǎng)為496個(gè)。Sazanov等用熒光原位雜交(FISH)分析將牛PRKAG1基因定位于5q21-q22上[12]。后來(lái)McKay等用全基因組輻射雜交圖譜證實(shí)了這一結(jié)論,Benkel等確定了牛PRKAG1基因的結(jié)構(gòu),其序列包括12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子[13]。各物種的PRKAG3基因序列都包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子[14]。Yu等運(yùn)用韓國(guó)牛BAN文庫(kù),確定了牛PRKAG3基因的結(jié)構(gòu)和序列,PRKAG3基因包括13個(gè)外顯子,總長(zhǎng)度約有 6.8 kb,編碼的氨基酸全長(zhǎng)為465個(gè),用Northern雜交分析證明牛與其他物種相似,且牛的PRKAG3基因也只在骨骼肌中表達(dá)[15]。Roux等分析了3個(gè)品種牛的PRKAG3基因序列及蛋白質(zhì)序列,確定了牛PRKAG3基因包括13個(gè)編碼外顯子,和一個(gè)3'非編碼外顯子,在豬中影響肉質(zhì)的突變位點(diǎn)在牛中突變頻率較低[16]。因而初步推斷牛PRKAG3基因也可能與肉質(zhì)有關(guān)。

2 AMPK的功能

2.1 AMPK活性的調(diào)節(jié)

AMPK的活性主要受細(xì)胞中AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)。此外,AMPK的活性也受酶的調(diào)節(jié),目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AMPK的上游激酶有兩種:腫瘤抑制蛋白LKB和兩個(gè)附屬亞單位STRAD和MO25形成的復(fù)合體;鈣調(diào)蛋白依賴(lài)蛋白激酶激酶(CaMKK)。下游激酶已發(fā)現(xiàn)達(dá)數(shù)十種。人工合成的激動(dòng)劑也能夠使AMPK活化,目前研究最為廣泛和深入的是5-氨基-4-甲酰氨咪唑核糖核苷酸(AICAR)。然而AICAR并非AMPK的特異性激動(dòng)劑。AICAR是一種腺苷類(lèi)似物,能夠被細(xì)胞攝取,在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸衍生物5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷(ZMP),具有AMP樣作用,而ZMP也能夠影響其他AMP調(diào)節(jié)的酶(磷酸酯酶,果糖-1,6-二磷酸酶)的活性。盡管AMP/ATP比值升高是激活A(yù)MPK的經(jīng)典途徑,但許多激素、細(xì)胞因子都參與了AMPK信號(hào)途徑,如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、二甲雙胍和羅格列酮等也可激活A(yù)MPK。瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的激素,在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、葡萄糖攝取及阻止脂質(zhì)在非脂肪組織聚積中起重要作用,有研究表明瘦素可能是通過(guò)AMPK對(duì)代謝起調(diào)節(jié)作用的。脂聯(lián)素是一種對(duì)抗糖尿病胰島素抵抗的激素,來(lái)自脂肪細(xì)胞,具有調(diào)節(jié)能量代謝、葡萄糖和脂肪代謝的作用。

2.2 AMPK對(duì)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)

在哺乳動(dòng)物中,AMPK的活性與細(xì)胞能量水平密切相關(guān)。AMP/ATP比率的增加,能促使AMPK得到激活。AMPK被激活則ATP消耗的途徑將被關(guān)閉,而ATP生成的途徑將被開(kāi)啟。近來(lái)的研究表明,AMPK可能在更大范圍內(nèi)對(duì)全身的能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2.1 AMPK對(duì)脂質(zhì)代謝的作用 AMPK激活后不僅能增加脂肪酸氧化,而且還有抑制脂肪合成的作用。AMPK 活化使β-羥基-β-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)以及甘油磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)磷酸化失活,從而抑制膽固醇和脂肪酸的合成[17,18]。AMPK對(duì)脂質(zhì)的另一調(diào)節(jié)途徑表現(xiàn)在對(duì)激素敏感脂酶(HSL)的作用上。

2.2.2 AMPK對(duì)糖代謝的作用 AMPK調(diào)節(jié)葡萄糖攝取可能通過(guò)兩種方式起作用:促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT)表達(dá)增加[19]。Halse在對(duì)離體骨骼肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn) AMPK不僅促使葡萄糖攝取,還抑制糖原的合成,從而促進(jìn)葡萄糖向糖酵解方向轉(zhuǎn)化。大量研究結(jié)果表明,用不同方法活化AMPK可以增加肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,其機(jī)制可能是由于激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1和GLUT4所致。AMPK的激活引起糖酵解的限速酶-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)磷酸化,刺激2,6-二磷酸果糖產(chǎn)生,從而促進(jìn)糖酵解產(chǎn)生更多ATP。此外,AMPK的活化還能減少糖異生酶(如1,6-二磷酸果糖激酶、烯醇化酶)的表達(dá),抑制糖異生,以及通過(guò)磷酸化糖原合成酶(GS)抑制糖原的合成[20]。

2.2.3 AMPK對(duì)蛋白質(zhì)代謝的作用 AMPK對(duì)蛋白質(zhì)合成代謝的抑制作用體現(xiàn)在對(duì)真核延長(zhǎng)因子(eEF-2)激酶和哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶體(mTOR)的作用上。eEF-2是蛋白質(zhì)合成中肽鏈延伸所必需,可調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄,參與肽鏈的延長(zhǎng),其活性可被eEF-2激酶通過(guò)磷酸化而抑制。而AMPK可能通過(guò)激活eEF-2激酶,使eEF-2磷酸化失活,導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受到抑制。mTOR作為胞漿內(nèi)的激酶,是蛋白質(zhì)翻譯中的重要調(diào)節(jié)物,生長(zhǎng)因子可激活它,而營(yíng)養(yǎng)撤除可抑制其介導(dǎo)的信號(hào)通路。有研究表明,AMPK和mTOR信號(hào)通路相關(guān)聯(lián),活化的AMPK通過(guò)抑制mTOR及其效應(yīng)器的活性,并增加eEF2的磷酸化,從而抑制蛋白質(zhì)合成[21]。

2.2.4 對(duì)膽固醇合成的調(diào)節(jié) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇合成的關(guān)鍵酶。ATP減少時(shí),AMPK激活使HMG-CoA還原酶的ser871位磷酸化而失活,因而膽固醇合成減少。有報(bào)道稱(chēng)細(xì)胞與纖維粘連蛋白(Fn)分離后激活A(yù)MPK,HMG-CoA還原酶受抑制,使細(xì)胞膜膽固醇合成減少,Fn附著細(xì)胞則相反[22]。

2.2.5 AMPK與動(dòng)物應(yīng)激情況下動(dòng)物代謝的關(guān)系A(chǔ)MPK在動(dòng)物應(yīng)激(生理、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和疾病等)過(guò)程中起著重要作用[23]。動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中,機(jī)體常遭受到來(lái)自外環(huán)境和生理因素的多種應(yīng)激,而不管是外界應(yīng)激還是自身應(yīng)激因素,都會(huì)給機(jī)體造成重大的影響,輕者造成采食量下降,生產(chǎn)性能降低,重者導(dǎo)致死亡。雖然目前仍缺乏這方面的試驗(yàn)證據(jù),但可以推斷AMPK在該過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)激條件下,AMPK被激活,抑制機(jī)體合成代謝,促進(jìn)分解代謝,從而導(dǎo)致生長(zhǎng)速率下降甚至失重。根據(jù)AMPK存在的廣泛性、進(jìn)化的保守性和功能的專(zhuān)一性,不難假設(shè),AMPK也與家畜應(yīng)激的調(diào)節(jié)有關(guān)。高產(chǎn)奶牛的酮病,可能與應(yīng)激使AMPK的活化有關(guān)。

3 牛AMPK家族基因的研究現(xiàn)狀

3.1 AMPK家族基因遺傳多態(tài)性的研究

Zhang等在4個(gè)牛品種PRKAB1基因7個(gè)外顯子及外顯子-內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)29個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs):4個(gè)位于5'-UTR;8個(gè)位于編碼區(qū),包括1個(gè)無(wú)義突變,1個(gè)錯(cuò)義突變,6個(gè)同義突變;17個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)。此外在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)SNPs和一個(gè) 10 bp的插入和一個(gè) 4 bp的缺失[24,25]。Benkel等在三個(gè)優(yōu)秀的肉牛品種中,檢測(cè)了PRKAG1基因外顯子9到11的序列,在內(nèi)含子10中發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs[13]。Yu等在PRKAG3基因四個(gè)牛品種中發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNPs。Roux等在3個(gè)牛品種中共發(fā)現(xiàn)了PRKAG3基因的32個(gè)SNPs,其中13個(gè)位于編碼區(qū),1個(gè)位于3'非翻譯區(qū),18個(gè)位于內(nèi)含子中。5個(gè)導(dǎo)致了氨基酸的改變,且位于編碼區(qū)等位基因突變的頻率較低。在該基因的兩個(gè)位置上發(fā)現(xiàn)了可變剪切位點(diǎn),導(dǎo)致了群體中出現(xiàn)異種蛋白[26]。McKay等利用混合測(cè)序法在牛PRKAG3外顯子2中發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變其中1個(gè)同義突變和1個(gè)無(wú)義突變。

3.2 AMPK家族基因在其他方面的研究

Zhang等關(guān)于AMPK家族基因不同物種間密碼子使用頻率的研究顯示,基因的功能是決定密碼子使用偏好性的優(yōu)勢(shì)因子,而物種差別只是很小的因素[27]。Benkel等的研究表明牛AMPKγ1蛋白編碼區(qū)其核苷酸序列與人和鼠的同源性分別為93%和90%,而牛AMPKγ1蛋白的氨基酸序列與人和鼠的一致性分別為98%和95%[11]。Roux等的研究結(jié)果表明牛AMPKγ3蛋白與人、豬和鼠的一致性分別為84%、83%和81%[26]。

4 AMPK家族基因的應(yīng)用前景

AMPK廣泛存在于真核細(xì)胞中,哺乳動(dòng)物的AMPK屬于高度保守的蛋白激酶家族,它是蛋白激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的中心元件,在調(diào)節(jié)能量代謝的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起著樞紐作用。AMPK在功能上的特點(diǎn)及進(jìn)化上的保守性,說(shuō)明該酶系在生物的遺傳與進(jìn)化過(guò)程中起重要作用,有研究顯示在其他物種上的一些突變,可以改變AMPK的信號(hào)傳導(dǎo)和多個(gè)代謝途徑,也可推斷其在牛上亦有相同的作用,通過(guò)對(duì)其代謝的影響進(jìn)一步影響其生長(zhǎng)狀況;應(yīng)激條件下,AMPK被激活,機(jī)體合成代謝受抑制,分解代謝加快,從而生長(zhǎng)速率下降甚至失重;該基因在其他物種上與疾病的相關(guān)性,也可以認(rèn)定為是牛抵抗疾病的候選基因;AMPK在下丘腦攝食調(diào)控中起作用,激活A(yù)MPK促進(jìn)攝食,抑制AMPK引起厭食,從這一研究結(jié)果可以推測(cè)AMPK的突變也可能會(huì)對(duì)牛的體重產(chǎn)生影響。此外,人工激活劑AICAR可以通過(guò)激活A(yù)MPK進(jìn)而對(duì)牛卵母細(xì)胞的核成熟有抑制作用[28],這一結(jié)果可以較好的為牛業(yè)同期發(fā)情處理提供理論資料。隨著對(duì)AMPK研究的日趨深入,人們對(duì)AMPK的功能已經(jīng)有很多方面的了解。在牛上對(duì)該基因的研究及其對(duì)功能的驗(yàn)證,可以促進(jìn)其對(duì)生產(chǎn)的指導(dǎo)作用,進(jìn)一步為動(dòng)物的遺傳育種提供理論依據(jù)。當(dāng)然,目前階段的研究尚不成熟,還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究,尤其是與生產(chǎn)性能相關(guān)的研究報(bào)道很少。

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