孫加節(jié),張春雷,房興堂,陳 宏＊,2

(1.徐州師范大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,江蘇 徐州 221116;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100)

核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是一種富含亮氨酸的小分子蛋白多糖,由富含亮氨酸的核心蛋白和一條糖胺聚糖鏈組成,主要分布在人和動(dòng)物的主動(dòng)脈 、肺 、皮膚 、腎臟 、肌腱 、平滑肌 、骨 、軟骨 、臍帶 、韌帶、胎盤及角膜等部位的結(jié)締組織中,屬于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分,與膠原纖維緊密相連,又叫 PG-2、PG-Ⅱ、PG-S2、PG-40 或 DS/CS-PGⅡ。由于電鏡下顯示其在膠原網(wǎng)絡(luò)中能夠修飾膠原纖維,故又稱為飾蛋白聚糖[1,2]。1978年,首次由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院骨科研究所的Fisher教授分離、純化[3]。1986年,Krusius等[4]通過提取人胚胎成纖維細(xì)胞系IMR290RNA、構(gòu)建cDNA文庫(kù),成功克隆DCN基因并測(cè)序鑒定。DCN的核心蛋白可以結(jié)合多種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor,TFG-β)、纖連蛋白(fibronetin,FN)、血栓素結(jié)合蛋白(thrombospondin)及DCN胞吞受體等,并且具有多種生物活性,包括調(diào)節(jié)和控制組織形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、增生以及參與膠原纖維的形成等過程。

1 Decorin的分子結(jié)構(gòu)

核心蛋白聚糖(DCN)由一個(gè)球形的核心蛋白和一條含硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮膚素(dermatar sulfate,DS)葡糖胺聚糖側(cè)鏈(glycosaminoglycans,GAG)組成[3]。DCN基因在人類基因組為雙拷貝,定位于12號(hào)染色體12q21-q22[5]。其核心蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為39 793,以富含10～12個(gè)亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕卣?每個(gè)結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度約相當(dāng)于24個(gè)氨基酸。人類DCN由359個(gè)氨基酸組成的(即包括3個(gè)終止密碼子 TAA在內(nèi)共1 080 bp編碼),包含了N末端16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、14個(gè)氨基酸的前肽以及329個(gè)氨基酸組成的成熟核心蛋白[4],按其作用不同可分為4個(gè)功能域(functional domains)[6]。第一功能域包括最開始的N-末端的30個(gè)殘基,其中分別代表含有16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(signal peptide)和14個(gè)氨基酸的前肽(propeptide)。信號(hào)肽可引導(dǎo)新翻譯的核心蛋白進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工結(jié)合GAG鏈并切除信號(hào)肽自身,而前肽含有許多酸性氨基酸,它可協(xié)助調(diào)節(jié)單鏈GAG與第二功能區(qū)N-端上的絲氨酸殘基結(jié)合。GAG側(cè)鏈連接成熟DCN氨基末端的一個(gè)絲氨酸殘基處,即為第二功能域的起始,葡糖胺聚糖鏈連接后與其他的GAG側(cè)鏈或者另外的核心蛋白發(fā)生相互作用,并為血栓素結(jié)合蛋白產(chǎn)生一個(gè)特異結(jié)合位點(diǎn)。GAG側(cè)鏈結(jié)合點(diǎn)緊隨的是一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域,區(qū)域的中心是核心蛋白(core protein),則為第三功能域,其最大特點(diǎn)是在長(zhǎng)度上包括24個(gè)氨基酸的富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRRs),亮氨酸的殘基定位于 1、4、6、11 和14的LRRs片段中,LRRs基本特性是促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用,可與 TGF-β發(fā)生結(jié)合反應(yīng),也是膠原特異性結(jié)合位點(diǎn)。第四功能域是位于C-末端的部分,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是包含一個(gè)保守的34～41個(gè)殘基的二硫化物環(huán),還包括膠原纖維和纖連蛋白細(xì)胞結(jié)合域的結(jié)合位點(diǎn)。

2 Decorin的生物合成

人類DCN基因的啟動(dòng)子(promoter)被分為兩個(gè)確切的區(qū)域:約含188個(gè)堿基對(duì)的近側(cè)區(qū)和800個(gè)堿基對(duì)的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)[7]。近側(cè)區(qū)包括一個(gè)CAAT盒(上游啟動(dòng)子元件)和位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)處的緊密排列的兩個(gè)TATA盒(真核生物啟動(dòng)子元件),該區(qū)域也包括兩個(gè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)反應(yīng)成分,DCN基因表達(dá)的下調(diào)可以被 TNF-α誘導(dǎo)的核蛋白所介導(dǎo),而后者則可以識(shí)別和結(jié)合近側(cè)區(qū)的TNF-α反應(yīng)成分。第144～188之間的48個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域是與主要轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)有關(guān)的部分,該區(qū)域包含激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)結(jié)合位點(diǎn),AP-1結(jié)合位點(diǎn)處有 DCN基因表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)因子[8]。DCN基因啟動(dòng)子的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)包含大量的Cis反應(yīng)成分(順式作用元件)及一個(gè)AP-1(轉(zhuǎn)錄因子)、一個(gè)AP-5(轉(zhuǎn)錄因子)、兩個(gè)NF-KB基序(反式作用因子)、TGF-β的負(fù)性調(diào)節(jié)成分等。其中TGF-β的負(fù)性調(diào)節(jié)成分已經(jīng)在多種蛋白酶的序列中被發(fā)現(xiàn),其功能可能是抑制DCN基因的轉(zhuǎn)錄。Borden等[9]觀察到用TGF-β處理過的腎小球膜細(xì)胞和鼠的肝細(xì)胞中的DCN基因的表達(dá)被上調(diào)。GAG側(cè)鏈的生物合成在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行,第二功能域的絲氨酸被木糖轉(zhuǎn)移酶(xylosyltransferase)識(shí)別,木糖轉(zhuǎn)移酶又被兩個(gè)半乳糖殘基構(gòu)成的三糖(trisaccharide)結(jié)合,糖醛酸(uronic acid)和半乳糖(galactosamine)共同建構(gòu)核心結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可以在不同的水平上被修飾[10]。DCN的來源可以采取以下兩種方式:一是從組織中直接提取,二是可以利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)基因工程的產(chǎn)品,由于DCN廣泛分布于人和動(dòng)物的各種組織當(dāng)中,為此從組織中提取天然的DCN有廣泛的來源和技術(shù)上的可行性,如可以從動(dòng)物的組織中分離及純化DCN[11]。目前國(guó)內(nèi)王國(guó)華等[12]用二次色譜法分離提取出DCN,曹茂開等[13]用基因克隆技術(shù)成功獲得DCN。

3 Decorin的研究進(jìn)展

3.1 Decorin與組織纖維化

組織纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過程。它是指組織或器官纖維組織增生,膠原纖維明顯增加,包括細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分及量的改變。纖維化形成的關(guān)鍵是ECM的過度沉積,DCN的抗增殖活性能夠直接影響纖維化的形成。DCN是與膠原纖維相關(guān)的小分子間質(zhì)性蛋白多糖,主要由皮膚成纖維細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞等產(chǎn)生,能調(diào)節(jié)和控制組織形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、增殖及膠原纖維的形成等過程,對(duì)防止組織和器官的纖維化有重要作用。近年來對(duì)于纖維化的診斷和治療日益集中在分子和基因的水平,Isaka等[14]報(bào)道,給大鼠轉(zhuǎn)入DCN cDNA可治療腎小球腎炎所致的腎纖維化;Sayani等[15]在肥大性瘢痕中用DCN mRNA與TGF-β mRNA原位雜交研究顯示,DCN mRNA在組織受到損傷后12個(gè)月以內(nèi)缺乏,而在12～36個(gè)月之間有較高的表達(dá),正常組織中卻很少表達(dá),可能提示DCN在纖維化的形成中起雙向調(diào)節(jié)作用。Scott等[16]研究發(fā)現(xiàn),增生性瘢痕中DCN含量減少,只有正常組織的25%。DCN核心蛋白結(jié)構(gòu)與Ⅰ型膠原結(jié)合,通過GAG側(cè)鏈之間形成的抗平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)使膠原分子的側(cè)向裝配受限,調(diào)節(jié)膠原纖維的直徑,并保證其正確裝配。增生期瘢痕(keloid)中的DCN mRNA表達(dá)明顯減少,膠原原纖維間的塑形分子結(jié)構(gòu)消失,從而使膠原原纖維的形成和裝配失去限制。Neame等[17]在DCN與lumican調(diào)節(jié)膠原原纖維形成的研究中發(fā)現(xiàn),DCN延遲纖維化初期的進(jìn)程,并減小纖維的直徑,DCN與lumican協(xié)同作用比單獨(dú)作用顯示更大的延緩纖維化形成;研究顯示lumican并不競(jìng)爭(zhēng)膠原纖維上DCN的結(jié)合位點(diǎn),而且二者共同作用還增加纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。免疫電鏡示DCN可大量存在于膠原纖維的附近,通過調(diào)整膠原纖維的C-末端,在膠原形成的起始階段延遲原膠原纖維的組建,使膠原數(shù)量減少。Mietz等[18]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附沉淀(ELISA)法在體外培養(yǎng)Tenon′s囊纖維原細(xì)胞中加入100 g/L的DCN,發(fā)現(xiàn)能減少50%的Ⅰ型膠原纖維和80%的Ⅱ型膠原纖維的含量,并認(rèn)為在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)纖維原細(xì)胞的蛋白質(zhì)無毒副作用。目前,一些國(guó)家已經(jīng)嘗試將提取和人工合成的DCN通過適當(dāng)?shù)耐緩接糜趧?dòng)物和人體進(jìn)行抗纖維化的治療,國(guó)內(nèi)也有用DCN干預(yù)纖維化的成功實(shí)驗(yàn)報(bào)道。相信以后DCN在這個(gè)領(lǐng)域的研究會(huì)更加成為熱點(diǎn)。

3.2 Decorin與腫瘤

近年研究發(fā)現(xiàn)DCN是多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的配體,參與細(xì)胞信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)調(diào)控,特別是在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,而成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)。Santra等[19]給培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染decorin cDNA,觀察到軟瓊脂培養(yǎng)基上形成的腫瘤體積明顯變小。并且,這種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制可以被decorin基因的反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)。Nash等[20]用兩種卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和2 774體外培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入150～400 mg/mL濃度的Decorin,發(fā)現(xiàn)其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用,并且這種抑制和卡鉑有協(xié)同效應(yīng)。加入Decorin到肺鱗癌細(xì)胞株A431培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)Decorin同樣可以使肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯,并通過流式細(xì)胞方法檢測(cè)證明腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在 G1期[21]。Koninger等[22]也發(fā)現(xiàn)Decorin可以通過細(xì)胞生長(zhǎng)周期的G1-S關(guān)卡點(diǎn),阻滯、延緩胰腺癌細(xì)胞增殖。膠質(zhì)瘤細(xì)胞株分別進(jìn)行Lewis大鼠顱內(nèi)接種,結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)decorin基因的CNS21細(xì)胞株接種的大鼠,體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)減緩,其荷瘤生存期明顯延長(zhǎng),兩組比較有顯著性差異[23]。Stander等[24]用三種其他神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN218、LN2229及 T98G轉(zhuǎn)染decorin基因后進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)接種,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染decorin基因后的腫瘤細(xì)胞株在體內(nèi)形成的瘤體明顯減小,并且瘤體周圍有明顯的激活T細(xì)胞浸潤(rùn)。還有比較早的研究用轉(zhuǎn)染decorin cDNA的結(jié)腸癌細(xì)胞接種小鼠,與非轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞能成功接種相對(duì),轉(zhuǎn)染decorin cDNA的結(jié)腸癌細(xì)胞不能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)形成瘤體[19]。另外,Grant等[25]通過研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)decorin基因的腫瘤細(xì)胞株接種裸鼠后,不但形成的腫瘤體積小,而且腫瘤血管再生能力也明顯減弱,瘤體內(nèi)血管密度降低。Reed等[26]通過另一種方式證明了decorin基因的體內(nèi)抗腫瘤作用。他們先給裸鼠接種A431肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株,在接種5～12天,裸鼠出現(xiàn)接種的瘤體后,多次瘤體內(nèi)注射decorin基因的腺病毒載體。結(jié)果移植瘤體生長(zhǎng)減緩,瘤體與正常組織分界變清楚,并且在鱗狀細(xì)胞癌的移植瘤體內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)個(gè)角化珠。也就是decorin基因在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí),還有促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。Tralhao等[27]的研究更加令人振奮,他們的結(jié)果提示decorin基因的抗腫瘤作用不限于給藥腫瘤的局部,以及decorin基因的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用具有選擇性。隨著對(duì)decorin基因及Decorin與腫瘤關(guān)系研究的深入以及對(duì)其作用機(jī)制的全面認(rèn)識(shí),它或許會(huì)在惡性腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

3.3 Decorin與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育

Decorin是肌肉細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分。在骨骼肌分化中,他們能夠結(jié)合幾種細(xì)胞外基質(zhì)和胞漿膜蛋白,調(diào)節(jié)肌肉的形成[28]。在早期的四肢肌肉形成過程中,觀測(cè)到肌肉形成的起始與decorin表達(dá)具有時(shí)空相關(guān)性[29]。為了評(píng)價(jià)decorin在活體分化中的功能,將野生型和decorin缺失的成纖維細(xì)胞移植到雞的肢芽上。Decorin的缺乏增加了生肌細(xì)胞的遷移,并在四肢上有更廣泛的分布,這和骨骼肌分化的抑制相關(guān),所有的表型在decorin重新表達(dá)后得到恢復(fù)[30]。MSTN,TGF-β超家族的成員,是一個(gè)胚胎期和生后的骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。它的功能是在發(fā)育的過程中維持適當(dāng)?shù)募∪夂?并分布在成體中的骨骼肌、心臟、和脂肪組織中。無MSTN基因的純合老鼠骨骼肌含量是野生老鼠的二到三倍[31]。近來,表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振表明DCN與MSTN之間存在互相作用[32],一種鋅離子依賴的相互作用,并通過DCN核心蛋白調(diào)節(jié)。有趣的是,在試管中,固定化的DCN能夠恢復(fù)MSTN對(duì)成肌細(xì)胞的增殖抑制效果,表明DCN可能束縛MSTN到細(xì)胞外基質(zhì),并調(diào)節(jié)其在成肌細(xì)胞中的活性。這種影響可能在鼠骨骼肌發(fā)育中起關(guān)鍵作用,因?yàn)镈CN和MSTN的mRNA表達(dá)方式是相似的,并在胚胎中明顯高于新生和成年的含量[33]。

3.4 Decorin在牛上的研究進(jìn)展

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)DCN基因的研究主要集中在人與鼠上,而關(guān)于牛的相關(guān)研究還比較少。牛DCN基因結(jié)構(gòu)比較保守,一般由8外顯子、7個(gè)內(nèi)含子及其他相關(guān)DNA元件組成(GenBank登錄號(hào):NC 007303)。該基因全長(zhǎng)約39 kb,其mRNA全長(zhǎng)2 160 bp,編碼360個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):NM 173906)。在以基因印記的方法來探索動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,Hasan Khatib[34]以牛的肝、腎、腦、肺、心臟、腦下垂體、肌肉、骨、胰腺、卵巢、羊膜、尿囊和絨毛膜等組織作為其研究對(duì)象,設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增牛各組織DCN基因1041 bp的cDNA。測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的序列NM 173906比較,結(jié)果顯示序列在 nt315和 nt648發(fā)生 A>G突變,在nt789發(fā)生C>T突變,且牛的DCN基因不具有印記特征。在探索胎牛肌肉組織形態(tài)發(fā)生過程中,Nishimura與他的同事[35]研究了DCN基因的表達(dá)和空間分布。免疫印跡分析表明,核心蛋白聚糖已經(jīng)存在于2.5個(gè)月的胎牛骨骼肌組織中,且早期胚胎階段糖胺聚糖鏈較晚期胚胎階段長(zhǎng),但核心蛋白大小相同。在胎牛發(fā)育一個(gè)月后,mRNA開始表達(dá),但其水平相對(duì)較低。免疫熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,在胎牛骨骼肌發(fā)育過程中,核心蛋白聚糖存在于組成膠原纖維的肌束膜中,而不是骨骼肌肌內(nèi)膜?，F(xiàn)在,雖然對(duì)于牛 DCN基因研究較少,但隨著對(duì)DCN基因研究的深度和廣度的增加,尤其是DCN基因的功能、表達(dá)、調(diào)節(jié)以及相關(guān)性研究,將得到發(fā)展和完善。

4 Decorin在肉牛育種中的應(yīng)用展望

DCN基因可作為用來尋找與抗病及生產(chǎn)性能相關(guān)的侯選基因。目前,功能基因的克隆測(cè)序、定位和基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的相關(guān)性分析以及分子系統(tǒng)進(jìn)化的研究己成為動(dòng)物遺傳育種的熱點(diǎn)之一。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)DCN基因研究較多,特別是近年來對(duì)其在抗纖維和抗腫瘤方面的研究,但是真正對(duì)DCN基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能的相關(guān)性研究還比較膚淺,還不能在牛的育種和生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。在今后的研究中,應(yīng)根據(jù)DCN基因的多態(tài)性來判斷其基因型,并對(duì)這些不同基因型進(jìn)行分析,找出各種基因型與數(shù)量性狀的相關(guān)性,從而將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物育種實(shí)踐中去。

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